氯喹对戊四氮慢性致痫大鼠脑皮质及海马腺苷激酶表达的影响

癫痛是中枢神经系统常见病和多发病，如何有效地防治癫痈是当今神经医学研究领域的一个热点大量临床观察和实验证实，癫痛发生发展过程中，除了神经元存在病理改变外.还伴随显著的星形胶质细胞(ASt)增殖异常及功能障碍。近期有研究者指出，内源性抗惊厥剂腺昔和兴奋性神经递质谷氨酸和在癫痈的发生发展过程中发挥了关键作用}司。尤其是腺昔，作用非常显著。由于腺普的调节依靠ASt及其关键酶—腺普激酶(ADK)，因此有学者提出“ADK假设”，认为ADK作为调节腺普浓度水平的关键酶，具有潜在的抗癫痈和神经保护作用。因此，研究Ast增生、ADK上调与癫病发作的关系，并探寻其干预措施具有重要意义。本实验采用氯喳作为干预剂，通过研究戊四氮(PZT)致痈大鼠皮质和海马区ADK的表达以及氯喳对其作用的影响，为进一步揭示癫痛发生机制以及开发新型抗癫痈药物提供思路。

材料与方法

一、实验动物及分组SPF级成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，购自山东烟台绿叶制药有限公司，批号:SCXK(鲁)20030008。体质量120-150 g，实验室条件下饲养。实验大鼠采用数字随机表法分为3组:对照组、PZT致痛组、氯喳干预组，每组10只。

二、模型制备1.慢性癫痈模型制备:对照组大鼠给予生理盐水腹腔注射，剂量40 mg/kg，每日1次PZT致痛组、氯唆干预组大鼠给予0.5%PTZ(美国Sigma公司)溶液腹腔注射，剂量为40 mg/kg，每日上午8;00给药，每日1次。给药2h后观察实验大鼠的行为学表现。连续给药7d左右，在首次观察到动物癫痛发作时，继续给药，并记录实验动物癫病发作情况癫痈发作分级参照Racine评分标准[[9]，凡连续至少5次出现11级以上痈样发作的大鼠被认为慢性癫痛模型点燃成功。2.氯唆干预:慢性癫痈模型制备成功后，致痛组给予维持量PTZ(20 mg/kg)以确保维持癫病反复发作状态，氯喳干预组给予氯喳治疗，剂量为40 mg/kg(美国Sigma公司)，每日上午8:00给药，观察给药后2h内大鼠的行为学表现，连续治疗2周。

三、行为学观察和脑电记录.观察并记录3组实验大鼠的行为表现，参照Racine评分标准，分为5级:0级为无反应;I级为节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛;II级为点头并伴有更严重的面部肌肉抽动阵挛，IQ级为出现前肢阵挛但不伴随直立;W级为前肢阵挛伴随直立;V级为全身强直阵挛而跌倒。点燃成功的癫病大鼠经40 g/L水合氯醛麻醉后固定于脑立体定位仪上，采用皮下针形电极，植人点为海马:前自后3.8 mm、中线两侧旁开2.0 mm，硬膜下0.5 mm;皮层:前自前2 mm、中线旁开2.0 mm，硬膜下0.5 mm，分别对海马区、额叶皮层区进行脑电记录。脑电记录仪采用ASB240U生物信号采集分析系统，耳朵作为单极参考记录，定标:灵敏度500},V,滤波为2 Hz，时间常数为0.2

四、免疫组织化学染色检测ADK实验大鼠快速冰上开颅取脑，40目L多聚甲醛固定，对组织进行脱水、透明、浸蜡处理后进行包埋、制片。切片经烤箱烘烤30 min，依次浸人二甲苯、梯度酒精进行脱蜡至水化，切片置于3%过氧化氢中20 min,阻断内源性过氧化物酶，微波抗原修复，封闭液封闭，加人兔抗ADK抗体(1:200，北京博奥森公司)4 0C过夜。复温1h，加入二抗，37 0C 30 min,DAB显色，苏木素复染，盐酸分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察，各步骤之间用0.01 mol/L PBS充分洗涤。阴性对照实验用PBS代替一抗孵育切片。

五、结果判定及量化采用Image-proplus高清晰度彩色病理图文分析系统进行图像分析。观察每例实验动物海马区和大脑皮质区的ADK表达，以细胞质染成棕黄色为阳性标志。每张切片随机观察5个200倍视野，应用显微图像分析系统，计数阳性细胞并测定其吸光度(A)值，数据由图像分析系统自动计算。六、统计学处理采用sPSSI9.o统计学软件进行处理，病样发作程度比较采用Mann-Whitney U检验，ADK免疫组化A值差异检验采用方差分析及SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、行为学观察和脑电记录

对照组无痈样发作。PTZ致痛组出现级别不等的痛样发作，较氯喳干预组明显加重，差异有统计学意义(P<0.05}(表1}。脑电图记录显示对照组无痛样放电，出现平缓，低平的波形;PTZ致痛组出现频发、高幅的尖波、棘波;氯唆干预组则显示慢波、小棘波(图1)

二、ADK免疫组化结果

ADK表达于胞浆，在对照组大鼠脑内Ast内微弱表达(图2,3)。在PTZ致痛大鼠的海马和皮质中，ADK表达明显增强，以海马为著(图},5)}，与对照组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.05).氯喳干预组大鼠ADK表达明显降低，尤其是在海马区(图6,7)，与PTZ致病组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.05);但在皮质区，氯喳干预组与PTZ致痈组ADK的表达差异无统计学意义(P>0.05).氯唆干预组海马及皮质区ADK的表达与对照组差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)

讨论

ADK在脑组织内主要由Ast表达，是内源性抗惊厥剂—腺昔的关键调节酶。腺昔作为一种非常有效的抑制性神经递质，广泛分布于中枢神经系统中[8]:正常生理情况下，ADK使细胞内腺普磷酸化后转换为一磷酸腺昔(AMP)，细胞内外的浓度梯度将使细胞外腺普通过胞膜上的转运体进人细胞内，而细胞内AMP可以代谢为二磷酸腺昔(ADP)至三磷酸腺昔(ATP),ATP分泌至细胞外又可以转化为腺昔，从而形成“腺昔循环”同。在这个循环中，细胞内腺昔代谢的关键酶是Ast源性的ADK。在正常情况下，ADK在脑内基础表达较低，主要表达于Ast的一个亚群。本实验也证实了这一点，ADK在对照组大鼠脑组织Ast胞浆内微弱表达。

许多关于癫痈发病机制的研究证明，Ast增生是癫痛的标志性病变.等研究发现，在局灶性癫痛的小鼠模型中，Ast增生、ADK过表达均局限于海马的CA3区，脑电记录的自发性癫痛波也局限于此区域。因此认为Ast增生、ADK上调和癫痈发作之间有“时间和空间的一致性”。本实验中，PTZ致痛组大鼠脑内Ast数量显著增多，排列紊乱，且细胞形态有所改变，胞体和胞核肥大，突起数量增多且短粗，形态不规则;在PTZ致痛大鼠脑内，可观察到大量ADK免疫阳性的细胞;同时脑电图显示频发、高幅的尖波、棘波，表明癫痈的发生与Ast增生和ADK的过度表达密切相关。Ast增生可导致ADK广泛表达，腺昔消耗随之增加，腺昔浓度下降，导致癫痛发作甚至进一步恶化。

本课题组前期实验已经证明，传统的抗疟剂—氯喳可以抑制Ast增殖，同时具有抑制细胞蛋白质合成和合成后修饰的一些酶活性的作用习本实验中采用氯喳作为干预剂，实验结果显示氯唆可以减轻PTZ导致的痛样发作，氯喳干预组大鼠脑电图显示慢波、小棘波，病样发作减轻，ADK表达亦明显降低，尤其是在海马区，表明氯喳通过对Ast增殖的控制降低了ADK的表达，是理想的抗病剂。但是实验结果也表明，氯喳干预组ADK表达虽然较癫痛组明显下降，但是与正常组相比仍然较高。这表明，慢性癫痈的持久发作造成的腺昔系统的失衡，单独采用氯喳并不能完全改善尽管如此，仍然可以看到ADK抑制剂在控制癫痈方面明朗的前景Fedele等[14]采用新型的Adktml Tg(Ubi-Adk)转基因鼠模型进行实验，在这种小鼠的脑内，大量的转基因ADK过度表达，造成这种转基因动物2/3的海马和皮层区域有自发性癫病样活动，但系统性全身给予ADK抑制剂后，则可有效预防癫痛发作。

综上所述，氯喳可以有效地抑制Ast增生，降低ADK的表达，表现出明显的脑保护作用。适当运用ADK抑制剂，提高局灶腺昔浓度，纠正腺昔系统功能的失调，可以为癫痛治疗提供新的思路。目前，以ADK为靶点的干细胞移植技术已经开展ys}癫病治疗出现了新的突破

参考文献

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