STAT3反义寡聚核苷酸对人脑胶质瘤细胞系U251细胞侵袭和凋亡的影响

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤，恶J胜程度高，呈浸润性生长，手术极难全切，辅以放化疗效果也不佳，因此寻找胶质瘤治疗的新靶点已成为目前研究的热点。诸多研究表明，信号转导及转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)在多种肿瘤中持续激活，在胶质瘤组织中亦呈高表达，活化STAT3具有强烈抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，并参与肿瘤的发生和演进。因此本研究采用STAT3反义寡聚核普酸敲低人脑胶质瘤细胞系U251中STAT3的表达，研究STAT3对人脑胶质瘤细胞生长的影响及其相关作用机制。

材料与方法

一、试剂

转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;嚓哩蓝(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司;细胞流式Annexin V/碘化丙陡(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自美国Invitrogen公司;PI及RNA酶(RNase A)购自美国Sigma公司;兔抗多克隆STAT3、兔抗多克隆磷酸化STAT3(pSTAT3)IgG、兔抗多克隆尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)、小鼠抗多克隆B细胞淋巴瘤/白血病一2相关X蛋白(B ax)、小鼠抗多克隆B细胞淋巴瘤/白血病一2(Bcl-2)一抗购自美国Cell Signal公司。

二、细胞培养及实验分组

人胶质瘤细胞系U251细胞购自中科院上海细胞库。细胞培养于含10%新生牛血清的DMEM(美国Gibco公司)培养基，并置于37 0C,5%COz孵箱中，取对数生长期细胞进行实验。细胞分为STAT3反义核普酸组、无义序列组和空白对照组。

三、STAT3反义寡聚核昔酸和无义序列的设计合成STAT3反义寡聚核昔酸和无义序列由上海吉玛公司设计合成，STAT3反义寡核昔酸合成序列:5'-GCTCCAGCATCTGCTTC-3';无义序列:5'-GA AGCAGCAGATGCTGGA-3’。

四、反义寡聚核营酸体外转染U251细胞

将U251细胞(1x106个//mL)置于12孔培养板中，37 0C,5%CO:培养24 h，细胞融合50%}60%左右。Lipofectamine 2000转染试剂分别和STAT3反义核昔酸、无义序列、溶剂按照1:1混合，孵育15 min后，分别加人到STAT3反义核普酸组、无义序列组和空白对照组细胞中。6h后换液，继续培养24 h后重复转染一次，再继续培养24 h，收集细胞用于以下实验。

1.MTT法检测细胞存活率:各组细胞转染后以每孔5x1个细胞的密度接种于96孔培养板，每组设5个复孔，加人培养液100},L/孔，37 0C,5%CO}继续培养48 h。每孔加人150},L二甲基亚矾(DMSO)溶解蓝紫色结晶,4 h后轻轻振动10 min,用酶标仪测定每孔吸光度值，取平均值。

2.流式细胞仪检测细胞周期:细胞转染48 h后收集细胞，300xg离心5 min后加人70%乙醇室温固定1h，再次300xg离心5 min，加人50},g/mL PI和50},g/mL RNase A,孵育1h后送流式细胞仪检测。

3.Annexin V/PI双染检测细胞凋亡:细胞转染48 h后收集细胞，300xg离心2次，每次5 mim，经Annexin V/PI双染后送流式细胞仪检测。

4.Transwell实验观察U251细胞的侵袭性:转染48 h后将各组细胞消化后重悬于含0.1%小牛血清培养基中，取5 x 10}/mL细胞100},L加至已铺Matrigel胶的8},孔径Transwell小室的上室，600},L 20%小牛血清培养基加人下室37 0C,5%CO-培养24 h后，取出Transwell，洗涤，固定，染色。用棉球擦去表面细胞，显微镜下观察

5.Western blotting检测相关蛋白表达水平:细胞转染48 h后收集细胞，RIPA裂解液裂解，收获蛋白并行BCA蛋白浓度测定试剂盒法定量，蛋白一上样于100 g/L SDS-聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE)凝胶电泳分离蛋白，湿转至聚偏二氟乙烯((PVDF)膜并用50 g/L脱脂奶粉于37℃条件下封闭1h，加人一抗((STAT3,pSTAT3 1:300稀释.uPAR,Bax,Bcl-2 1:500稀释)4℃孵育过夜，加人二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG)孵育1.5 h，以GAPDH作为内参，将超敏发光液加在PVDF膜上，曝光显影。

五、统计学处理

实验均独立重复3次，实验数据用均数士标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件进行统计，比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、STAT3反义核普酸对U251细胞增殖水平的影响

MTT检测显示STAT3反义核昔酸转染细胞48 h后，空白对照组、无义序列组、STAT3反义核昔酸组细胞相对存活率分别为(69.12士2.81)%,(67.42士3.32)%和((40.51士2.11)，差异有统计学意义(F--73.536,P=0.000)。与空白对照组、无义序列组比较，STAT3反义核普酸组细胞的相对增殖水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明STAT3反义核昔酸能够显著抑制U251细胞增殖能力。

二、STAT3反义核普酸对U251细胞周期的影响

流式细胞仪检测细胞周期结果如图1所不，S丁A丁3反义核什酸组、空白对照组、无义序列组G 1/GO期细胞比例分别为(61.51士3.22)%,(40.61士2.78)%,(37.2612.2)7%，比较差异有统计学意义(F--89.582,P=0.000)a STAT3反义核昔酸组G 1/GO期细胞比例明显高于空白对照组及无义序列组，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明STAT3反义核营酸能够有效诱导U251细胞周期阻滞在G1/GO期。

三、STAT3反义核昔酸对U251细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测细胞凋亡结果见图2，空白对照组、无义序列组、STAT3反义核昔酸组细胞细胞凋亡率分别为(1.8士0.32)%,}4.6士0.3 5)%和(18.0士1.81)%，差异具有统计学意义(F--104.782,P=0.000)STAT3反义核普酸组细胞凋亡明显高于空白对照组和无义序列组，差异有统计学意义(P<0.05)。表明转染STAT3反义寡聚核营酸促使胶质瘤细胞凋亡。

四、STAT3反义核苦酸对U251细胞侵袭能力的影响

Transwell实验结果见图3，空白对照组、无义序列组、STAT3反义核昔酸组滤膜细胞数目分别为(89.12士5.24)%，(86.72士5.68)%和(38.54士4.19)%，差异具有统计学意义(F--93.183,P=0.000)。其中STAT3反义核昔酸组滤膜细胞数明显小于空白对照组和无义序列组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明转染STAT3反义寡聚核昔酸能够有效降低胶质瘤细胞侵袭能力。

五、STAT3反义核昔酸对U251细胞相关蛋白表达水平的影响

采集不同处理组表达的灰度值进行分析，使用GAPDH作为内参对照，结果发现空白对照组、无义序列组、STAT3反义核昔酸组细胞STAT3蛋白相对表达量分别为62.34士5.72,69.76 16.25,34.82士4.91，差异具有统计学意义(F=125.426,X0.000)o pSTAT3蛋白相对表达量分别为87.34士7.96,94.39士6.12,41.42士4.15，差异具有统计学意义(F--152.627,P=0.000)二uPAR蛋白相对表达量分别为58.73 1 4.48,52.32士5.23,17.97士2.52,差异具有统计学意义(F--74.465,P=0.000)}Bcl-2蛋白相对表达量分别为47.72士3.63,51.2614.84,19.56士2.37,差异具有统计学意义(F--67.842,P=0.000)}Bax蛋白相对表达量分别为25.24士1.95,22.25士2.18,37.68士2.63，差异具有统计学意义(F--62.634,X0.002)两两比较显示STA丁3反义核普酸组STAT3,pSTAT3,uPAR和Bcl-2蛋白的表达降低、B ax蛋白增加，差异有统计学意义(P}0.05)，说明STAT3反义核昔酸能够有效敲低U251细胞中STAT3及pSTAT3的表达，且能够有效降低uPAR和Bcl-2蛋白表达水平，上调Bax蛋白表达量。(图4)

讨论

STAT3是信号传导子与转录激活子家族的重要成员，1994年作为IL,-6信号传递中的急性期反应因子被发现及纯化[}Z}}STAT3作为转录因子在没有特异性的刺激时定位于胞质内，当细胞受到如细胞因子、生长因子及癌基因的刺激时，STAT3通过与SH2结构与受体上的梭基端第705位((Y705)酪氨酸残基结合，被磷酸化转人细胞核，调控靶基因的转录。STAT3在正常情况下短暂激活，而在多种肿瘤及细胞系中却呈持续活化状态日:目前，在多种肿瘤组织中发现持续活化的STAT3，如结肠癌、乳腺癌、肺癌及胃癌等，证明STAT3与恶性肿瘤的发生发展密切相关.Rahaman等研究显示，几乎所有的胶母细胞系和90%以上的原发性胶质母细胞瘤(GBM)都有STAT3的持续激活，明显高于正常胶质细胞Weissenberger等对51例胶质瘤组织STAT3的表达进行检测，发现磷酸化STAT3在人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中高表达，并随着肿瘤级别的增高而增加。进一步研究表明持续激活的STAT3能够促使细胞发生恶性转化并能在裸鼠中形成肿瘤，目前STAT3被公认为是一种癌基因因此，阻断肿瘤细胞中STAT3信号传导通路，靶向STAT3治疗为肿瘤的治疗提供了新的方法。

本实验应用STAT3反义寡聚核昔酸转染U251细胞，研究STAT3对人脑胶质瘤细胞增殖、周期、侵袭及凋亡方面的影响及相关作用机制。结果显示反义STAT3能够显著降低胶质瘤细胞中STAT3及活化STAT3蛋白表达水平。同时，反义STAT3能够明显抑制胶质瘤细胞生长，诱导细胞周期阻滞在G1期，降低细胞侵袭能力并促进其调亡。胶质瘤的侵袭转移是影响预后的一个重要因素，单个的胶质瘤细胞可以迁移到距离原发肿瘤4.07.0 cm的地方a uPAR通过与uPA结合形成复合物，参与肿瘤的局部侵润。恶性程度高的胶质瘤中uPAR表达水平较高，较低表达或不表达uPAR的患者其存活时间要短。而在调节细胞凋亡的蛋白中，Bcl-2和Bax蛋白是关键性调节因子，其中Bcl-2是重要的细胞凋亡的抑制因子，在多种人体恶性肿瘤包括胶质瘤中Bc1-2表达明显增高，并且其表达水平与胶质瘤等级成正相关，与胶质瘤预后关系密切;Bax是促凋亡基因，在胶质瘤组织中呈低表达，其表达水平增高可以促进肿瘤细胞的凋亡[13]。在进一步研究反义STAT3促进U251细胞凋亡的分子机制中.本实验发现反义STAT3组uPAR及Bcl-2表达明显下调，Bax表达明显增多，说明反义STAT3可能通过下调uPAR,Bcl-2表达，上调Bax表达水平抑制U251细胞侵袭，并诱导细胞凋亡。综上所述，反义STAT3能够有效抑制STAT3及活化STAT3蛋白表达水平，抑制胶质瘤细胞增殖，降低细胞侵袭能力并促进其凋亡。本实验通过反义STAT3敲低STAT3蛋白表达抑制胶制瘤细胞生长，为恶性胶质瘤的治疗提供了新的思路和潜在的治疗靶点。

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