中国男性不育患者CFTR基因M470V检测及其意义

囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)基因M470V多态性(rs=213950)[1]为CΠR基因外显子10上15翎位点上A→G多态导致的氨基酸替换,属于错义突变,其突变等位基因M/V多态性能影响CFTR蛋白氯离子通道活性。不同地区、不同人群中M470和V470的比例不同[2],M470V表达情况与个体胰腺功能、肺功能、生育能力等密切相关[3.4]。国内黄沁等[5]曾检测我国健康人群中M470V表达情况,为中国C田R基因相关疾病的研究提供重要的遗传学资料。但在我国生育力正常和不育人群中的M470V分布情况尚不清楚,是否与我国男性不育发生相关也不清楚。因此,本研究利用chngobe法检查中国精子发生正常人群与非梗阻性无精子症患者以及先天性双侧输精管缺如患者CFTR基因M钾0V多态性分布情况,以探讨CFTR基因M470V多态性改变与男性不育之间的关系。

1材料与方法

1.1标本采集

知情同意的情况下收集临床诊断明确的非梗阻性无精子症的男性患者67例、先天性双侧输精管缺如的男性患者95例以及因女方因素拟行试管婴儿助孕、精液常规检查正常的生育力正常男性135例。非梗阻性无精子症病例人选标准:①不育病史;②查体双侧睾丸容积正常或小于正常(小于121nl);③三次精液常规检查(离心沉淀镜检)均未见精子,排精后尿沉淀亦未见精子(排除逆行射精和不射精),精液pH值正常,精浆果糖及糖苷酶定量分析正常;④生殖激素检测"H正常或升高(大于12mu/lYll),染色体检查正常;⑤睾丸活检病理积分法评分介于2~8分之间。以上我院入选病例臼例。先天性双侧输精管缺如人选标准:①除原发不育外无其他囊性纤维化疾病症状或表现;②查体双侧睾丸大小发育正常,双侧扪不到输精管;③三次精液常规检查(离心沉淀镜检)均未见精子,排精后尿沉淀亦未见精子(排除逆行射精和不射精),精液pH值呈酸性,精浆果糖及糖苷酶定量分析显著低于正常;④生殖激素检测及染色体均正常;⑤附睾或睾丸穿刺取到精子。生育力正常男性人选标准:①因女方因素拟行试管婴儿助孕;②查体双侧睾丸发育正常;③精液常规检查正常;④染色体检查正常。

1.2基因组DNA提取采集外周血2ml,EDTA抗凝。使用DNA抽提试剂盒(QIAGEN)在BioRobot EZ1(QIAGEN)全自动核酸提取系统上自动抽提DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度,0D值介于1.8~2.0之间留用,否者重新抽提。将提取的DNA编号冷冻保存于-80℃冰箱。

1.3引物及探针合成

参考NCBI pome-blast[6],应用软件Primer5,0自行设计引物,上游引物5′-CTTCTGCTTAGGAT-GATAATTGG-3′,下游引物5′-GCTTGATGACGCT-TCTGTA-3′,由大连KaRa公司合成引物并制作相应的荧光探针应用Cycling probe法检测M470VsNP类型(详细信息见表1)。检测用引物及探针经验证PCR产物电泳显示为特异性目标条带,Real-Time PCR检测结果与PCR产物测序结果相符,可以用于M470VSNP位点的分型检测。

1.4cling probe法Red~Time PCR检测M470V

将冷冻保存的DNA样本常温解冻,按照说明书的操作方法配制PCR反应液,构建反应体系及Real~Time PCR反应条件,使用ABIOO(Apphed B汛yste鹏)上机检测,反应条件为:(1)预变性;(2)变性;(3)退火;(4)延伸,3ZIscc;(5)终末延伸,5min;(2)-(4)共⑩个循环。反应结束后根据检测结果结合扩增曲线分析,判定检测结果。

1.5统计学分析

应用SPSS13,0进行数据分析,使用卡方检验,P<0.O5视为有显著性差异。

2结果

分别记录检测结果(见表2),三组比较(生育力正常男性人群与先天性双侧输精管缺如患者以及非梗阻性无精子症患者)CFTR基因M470V基因型和等位基因分布频率无统计学差异(P值分别为0.4221和0.1794,P>0.05)。MV基因型为最常见的基因型,在生育力正常男性人群中的基因型频率为0.4296,其次为VV基因型,基因型频率为0.3704,最少见的为MM基因型,基因型频率为0.2。MM、MV、VV基因型在生育力正常男性人群中的分布符合哈迪-温伯格平衡定律X2=1.7871,P=0.1813,P>0.O5)。V470等位基因为生育力正常男性人群中最常见的等位基因,其等位基因频率为0.58犯,M狎0等位基因与Ⅵ⒛等位基因在生育能力正常的男性人群中的分布比例约为0.7:1。

3讨论

CFTR基因于1989年被Riordan首次克隆并鉴定[7],它位于7q31.2,全长188,704bp[8],共有26个内含子,27个外显子,mRNA序列6132bp,编码1条由1480个氨基酸组成的、命名为C田R(0MIM 602421)[9]的肽链,相对分子质量约为168,173。体内C田R蛋白的功能是由其基因型决定的,CmR基因M470V多态性(rs=213950)[1]为CFR基因外显子10上15碉位点上A→G多态导致的氨基酸替换,属于错义突变,在外显子10上15碉位点碱基为A,编码氨基酸为Met(甲硫氨酸),碱基为G编码的氨基酸为Val(缬氨酸),其突变等位基因M/V多态性能影响CFTR蛋白氯离子通道活性。研究发现不同地区、不同人群中M470和V钾0的比例不同,M470V本身既与生育能力相关,欧洲人群Me7o相比Va7o生育能力更低[2J。但M470V在我国生育力正常和不育人群中的分布情况尚不清楚。为明确我国生育能力正常男性人群和不育症患者中M470V发布情况,本研究利用Cr-hng p00be法检测生育力正常男性人群与先天性双侧输精管缺如患者以及非梗阻性无精子症患者CFTR基因M4⒛V多态性分布情况,以探讨CrR基因M0V多态性改变与男性生育力正常人群以及先天性双侧输精管缺如之间的关系。我们的研究结果显示在先天性双侧输精管缺如、非梗阻性无精子症(睾丸生精功能障碍)以及生育能力正常的男性之间M470V多态性分布无显著性差异,说明中国C田R基因皿泓W多态性改变本身与患者罹患先天性双侧输精管缺如或非梗阻性无精子症可能无关。这可能是因为以往的研究大多与C田R基因内含子8的TG-rcpeats、po△-T相结合有关[10]。单纯M470V改变在男性不育人群与正常人群中可能并无差异,但是当TG-repeats、po1y-T与M470V协同作用时,可能下调CFTR蛋白表达水平。二者或多者协同作用,进而导致CBAVD发生,甚至睾丸生精功能下降。M470V决定氯离子通道的内在活性,M/M470同TG11/11或TG11/12,M470同TG11/11可产生功能较高的C叫R,M/M470同TG1相结合,可降低功能完善的CFTR蛋白的产量,V/V470与TGII/11相结合可降低氯离子通道蛋白的活性,从而导致CFTR基因功能下降[15]。因此我们下一步的研究有必要拓展到TG-repeats,poly-T等其他CmR基因多态性改变或基因突变位点,进一步分析它们之间的内在联系,进一步明确M婀0V与其它基因位点间的协同作用。同时,我们的研究表明MM、MV,VV基因型在正常生育力男性人群中的分布符合哈迪-温伯格平衡定律。在生育力正常的男性人群中M470与V470等位基因分布频率比例大致,这与在健康中国人群中检测的结果相近0.8:1,相比欧洲人的比例1:1要低[16],这可能是自然选择的结果。传染性腹泻病曾是亚洲国家儿童死亡的主要原因之一[17]。V470可以使CⅢR蛋白氯离子通道活性下降,有助于罹患传染性腹泻时减少液体流失,从而减轻疾病的损害,有助于提高腹泻性疾病患者的存活率。在我们的研究中MM470基因型分布频率在30%左右,亦说明中国人群C叫R蛋白氯离子通道活性可能低下,但正常生育男性和非梗阻性无精子症患者以及先天性双侧输精管缺如患者之间未见明显不同。M470V是否会与其它基因位点突变协同作用而影响患者生育能力,罹患相关疾病等有待我们进行相关研究[3,20]。

参考文献

[1]Kosova G,Pickrell JK,Kelley JL.The CFTR Met470 allele is associated with lower birth rates in fertile men from a population isolate[J].PLoS Genetics,2010,(06):e1000974.

[2]Pompei F,Ciminelli BM,Bombieri C.Haplotype block structure study of the CFTR gene.Most variants are associated with the M470 allele in several European populations[J].European Journal of Human Genetics,2006,(01):85-93.

[3]Lee JH,Choi JH,Namkung W.A haplotype-based molecular analysis of CFTR mutations associated with respiratory and pancreatic diseases[J].Human Molecular Genetics,2003,(18):2321-2332.

[4]Huang Q,Ding W,Wei MX.Comparative analysis of common CFTR polymorphisms poly-T,TG-repeats and M470V in a healthy Chinese population[J].World Journal of Gastroenterology,2008,(12):1925-1930.

[5]查看详情[OL].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome,.

[6]Riordan JR,Rommens JM,Kerem B.Identification of the cystic fibrosis gene:cloning and characterization of complementary DNA[J].Science,1989,(4922):1066-1073.

[7]查看详情[OL].http://ghr.nlm.nih.gov/gene=CFTR,.

[8]查看详情[OL].http://www.omim.org/entry/602421,.

[9]Radpour R,Gourabi H,Dizaj AV.Genetic investigations of CFTR mutations in congenital absence of vas deferens,uterus,and vagina as a cause of infertility[J].Journal of Andrology,2008,(05):506-513.