烟曲霉实时PCR 检测方法的建立

随着科学技术的不断发展和医疗水平的不断提高，越来越多的患有白血病、艾滋病、糖尿病等疾病的人群得到了及时的救治，生命得以延续，但随着广谱抗菌药物、糖皮质激素、细胞毒药物及免疫抑制剂在临床被广泛应用，免疫低下人群数量也不断增多[16]，接踵而至的是条件致病菌引起的感染频繁发生，尤其是侵袭性曲霉菌感染，成为临床治疗中的棘手问题，再一次危及到了患者的生命安全，当前已引起了大家的重视[79]。早期有效的抗真菌治疗可以明显改善疾病预后，而当前实验室内的常规检测方法由于其敏感性和耗时性等缺陷，难以满足临床的需求，亟需寻求一种更加灵敏和特异的检测方法，为目前临床真菌感染的早期诊断、预防和治疗提供有效工具。随着近年来对真菌病原研究的不断深入，使人们重新看到了真菌PCR 在临床应用的曙光，本实验建立了一种针对烟曲霉病原菌进行检测的实时PCR 法，现报道如下。

1　材料与方法

1.1　材料　烟曲霉菌标准株(ATCC10896)基因组DNA，白色念珠菌标准株(ATCC90028)基因组DNA，解脲支原体基因组DNA，人基因组DNA，人巨细胞病毒(HCMV)基因组DNA，HBV 基因组DNA。

1.2　仪器与试剂　溶壁酶lyticase(Sigma，L4025，900 U/mL)，核糖核酸酶A(Sigma，RcR5500，10 mg/mL)，蛋白酶K(Biotech，LJ0127A2010J，20mg/mL，>30U/mg)，三羟甲基氨基甲烷盐酸乙二胺四乙酸缓冲液(TE，三羟甲基氨基甲烷盐酸10mmol/L，pH8.0，乙二胺四乙酸缓冲液1 mmol/L);酚氯仿异戊醇(25∶24∶1，上海生工)，SYBRPremixExTaq试剂盒(宝生物，RR420A)，100bpDL500DNAladder Marker。紫外分光光度计(Beckmancoulter，DU730)，冷冻离心机(Eppendorf，5415R)，生物安全柜(Thermo)，PCR 扩增仪(ABI7300)，柯达凝胶成像系统(Carestream，ImageStation4000R)。

1.3　方法

1.3.1　真菌基因组DNA 的提取　方法同前期实验[10]。

1.3.2　烟曲霉实时PCR 法的建立　将烟曲霉线粒体基因序列在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi数据库中进行比对，找出特有的靶序列部分，在靶序列上设计一对，上游引物：5′CTT GAA TAC TTC AGT AAC T3′，下游引物：5′CCTCTA TTT ACT AAA TCA TC3′，靶片段长度132bp。PCR 反应总体积为50μL，各成分用量参照SYBRPremixExTaq 试剂盒说明书;PCR 反应条件为：50 ℃，2 min;94 ℃ 预变性2min;94 ℃变性15s，55 ℃ 退火延伸40s，共40个循环。构建含靶片段的TA 克隆质粒(委托宝生物公司完成)，制备梯度浓度的双份样本，具体浓度为101、102、103、104、105、106、107、108copies/mL，进行PCR 扩增并作融解曲线分析，验证该方法的敏感性、稳定性与特异性，同时分别以非烟曲霉菌基因组DNA，即白色念珠菌标准株(ATCC90028)基因组DNA、解脲支原体基因组DNA、人基因组DNA、人巨细胞病毒(HCMV)基因组DNA 和HBV 基因组DNA 为模板，进一步验证该方法的特异性;将PCR 产物外送测序，验证方法的可靠性。

2　结　　果

PCR 扩增标准曲线的斜率-3.014383，截距40.882465，相关系数(r2)=0.997539，提示具有较好的相关性，满足实验要求，见图1(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。该PCR 检测体系的检测敏感性方面，线性检测范围的下限可至102copies/mL，上限可达108copies/mL;双份样本的检测结果总体一致，提示该PCR 检测体系的重复性、稳定性较好，见图2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”);溶解曲线分析显示为单峰，Tm=74.1 ℃，见图3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)，此外，以非烟曲霉菌基因组DNA为模板时均无扩增曲线出现，证明本PCR 扩增体系的特异性较好;将PCR 产物外送测序(英俊公司)，结果符合预期。

3　讨　　论

侵袭性真菌感染(IFD)十分普遍，主要由念珠菌属、曲霉属、隐球菌属等机会致病真菌(或条件致病真菌)引起，也可由组织胞浆菌、皮炎芽生菌、孢子丝菌等地方流行性致病真菌所致，其中，曲霉菌属已成为免疫低下患者二次感染的重要致命因素，IFD 的早期诊断和早期治疗对于改善患者预后有着重要意义[1112]，而当前真菌感染的特点是高院内感染率、低实验室诊断率、低临床诊断率和病情进展迅速，传统诊断方法包括深部组织培养法、组织/细胞病理学检测、13βD 葡聚糖(G 试验)、半乳甘露聚糖检测(GM 试验)和影像学检查(如CT)等，由于它们在敏感性、特异性等方面存在缺陷，难以满足临床早期诊断的需要，如何提高IFD 的早期诊断、早期治疗是国内外学者关注的热点问题，所以近年来IFD 的早期诊断方法的研究被广泛开展，虽然当前仍处于实验室研究阶段，但其应用前景广阔，值得期待。PCR 为基础的诊断学方法冷落的原因如下。(1)真菌的细胞壁坚固，破壁困难，从复杂的临床标本中提取真菌DNA的效率已成为阻碍提高诊断水平的重要因素;(2)当前没有设计出合适的质控对照，操作难以实现标准化;(3)相对其他病原菌，真菌的污染更加难以控制，易出现假阳性，真菌的孢子可呈气溶胶方式存在于自然环境中，他们对试剂和标本的污染会导致其检测结果产生假阳性，为此，Mengoli等[13]强调，为有效避免标本DNA 提取过程的交叉污染，实施PCR 检测真菌基因的实验室必须健全防范措施，其中包括在PCR 操作前或后采用单方向的工作流模式，PCR 分析前后实验操作要在不同的实验室进行(物理隔离)，使用防气溶胶的枪头和层流净化罩，以及在PCR 反应混合体系中，应当使用尿嘧啶DNA 糖基化酶(UDG)和脱氧尿嘧啶(dUTP)代替三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTT′P)，最终消除体系中存在的污染物;(4)最佳临床检测样本种类的选择国内外均尚未达成共识;然而，在过去的十年中真菌的PCR 诊断依然取得了明显的进步，本实验以烟曲霉线粒体基因组上的特异性序列为靶位，建立了敏感性、稳定性和特异性均较好的PCR 检测体系，将在下一步工作中应用于临床标本的检测，探讨其临床应用价值，使侵袭性烟曲霉病的早发现、早治疗成为可能，为实验室诊断率和临床诊断率的提高初步奠定了基础[1423]。

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(收稿日期：20131113)