NO检测方法的新进展及其在高原医学中的应用

一氧化氮(NO)是由内皮细胞分泌的一种脂溶性气体，由一氧化氮合成酶(NOS)在氧气、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)和四氢蝶呤的参与下，催化L精氨酸生成。NO 具有舒张血管、抗血小板凝集、抑制血管平滑肌生长等多种生物活性[1]。NOS包括神经元性(nNOS)、诱导性(iNOS)和内皮性(eNOS)三种形式[2]。nNOS和eNOS 一般在大脑和血管内皮细胞表达，而iNOS主要在呼吸道上皮细胞表达[3]。在缺氧条件下缺氧诱导转录因子(HIF1 和HIF2)激活NOS 基因的表达，使iNOS和eNOS表达增加，从而使组织产生NO 增加[45]，NO 气体通过自由扩散进入平滑肌细胞，激活可溶性鸟苷酸环化酶产生3′，5′环鸟苷酸(cGMP)，从而导致血管舒张。NO的代谢也可导致在组织蛋白和血液中的酪氨酸硝化，血红蛋白的变构状态也可以调节氮氧化物结构[610]，因而可以通过检测血液、唾液和尿液中具有生物活性的氮氧化物，来反映NO的含量。本综述总结了NO 的测定方法，NO 的计量单位以及NO 在高原习服、高原适应、高原病的发病中的作用。

1　在高原地区对呼出气体中NO 含量的测量方法目前在高原地区的NO 含量主要采用化学发光传感器和一次性电化学传感器两种技术测量。化学发光传感器分析器是基于对气相的化学发光光电倍增管，来检测电子激发态的二氧化氮光子排放量，二氧化氮是通过NO 与臭氧反应产生的，因此相应的NO 含量也可以换算出来。在使用这种仪器时虽然光电倍增管系统和反应室的设计可以代偿任何外部气压的变化，但是大气压的变化仍可以影响通过节流传感器的流率并且导致NO 信号的水平降低，因而必须用含有标准NO 气体的大气压进行校准，使样本流率的变化不影响在高原NO 的收集和测量，可以测定小于十亿分之一(ppb)的气相NO、1pmol液相NO 分子[11]。一次性电化学传感器是电化学性的测量方法，电极是位于一种用于测量NO 的溶液中，可以与扩散到容器中的气相分子发生反应。由于电化学传感器技术取决于促使气体进入反应室的扩散速度，而大气压又影响着气体的扩散速度，因此大气压的变化可以影响NO 的检测。高原上低气压环境导致了进入到反应室的气体量减少，这就降低了测量的精确度，同时由于这种实验仪器的性能因受大气压影响，而使它的操作范围海拔低于3100m 的地区。

2　NO 分析的样本采集及结果计量单位NO 广泛存在于人类呼出的气体中[12]。在20 世纪90 年代初，通过NO 的化学发光分析仪可以检测呼出气体中的NO，并且用于临床实验[1315]。在临床肺功能实验中常通过标准化法测量呼气中NO，它可以测量呼气早期的气道NO(在气体流入NO 分析仪的速度为50mL/s时前10s的呼气)，因而反映了前500～750 mL 呼出气体中NO 的含量[16]。相比之下，在不透性麦拉气球收集的呼出气体中，用offline方法可以测定来源于肺泡腔和血管内的NO，这种方法被推荐用于高原地区NO 水平的评价，而且屏气可以增加检测总量NO 的灵敏度[4，1718]。以上两种方法的区别是很重要的，因为这两个方法测量的是不同位置的NO，根据这两种收集方法的实验研究可能会得出相反的结论。NO 分析仪器报告的结果为NO 占呼出气体的ppb，可以将它换算成呼出NO 占呼出气体的部分压力(NO 分压)，可以比较不同海拔NO 含量。计量单位的不同可以影响NO 对比的结果，如果是气压，那么就把ppb转换成纳米汞柱(nmHg)。nmHg单位的NO 分压的计算如下：ppb 单位的NO 乘以nmHg单位时的周围环境气压然后再除以1000。因此在高原地区由于低气压的影响而使NO 分子数较少，所以从上述可知，高原地区的研究报道也应考虑大气压影响[19]。

3　体内合成之外的NO口腔细菌可以生产NO3- ，而且食品和饮料也可能会增加循环中有生物活性的NO2- 和NO3- 水平，这些都会影响NO的测定结果[20]。因而建议在收集呼出NO 时，受试者应禁食水1h[15]，充分考虑到上述可能增加呼出气NO 测量结果的因素[2122]。值得庆幸的是，研究表明平均日常消费的NO3- 还没有达到明显改变NO3- 或NO2- 含量的水平。例如有学者通过收集西藏农牧区的膳食信息，评价世居4200m 藏族人饮食中的NO [2325]，在这个研究中5名男子和5 名女子提供了他们的呼气和尿液，并提供了过去24h 的饮食摄入量并等份的食品和家庭供水。在他们的饮料(水、茶和青稞酒)中检测到了0～15μmol的NO2- 和0～70μmol的NO3- ，食物中不包括绿色蔬菜或其他来源(如腊肉)的NO3- ;典型膳食中包括低含量的NO2- (<0.4mg/kg)和NO3- (<125mg/kg)[26]。

4　NO 在高原习服适应中的作用平原人进入高原后，机体在神经体液调节下发生一系列的代偿适应性变化，以适应高原环境，这个过程称为习服。高原适应是指高原上的人群或动物种系发生了一种可以遗传的，并具有遗传基础的解剖上和生化上的特征，因而能很好地生活。在高原环境的过程[2728]。在高原医学领域，有许多关于NO 的研究，例如NO 含量、影响NO 生成的相关基因多态性与急性高原反应、高原肺水肿、高原适应或慢性高原病易感性，肺动脉压力，机体运动能力等的关系[29]。李红等[30]报道快速进入高原者进入高原后的NO 由平原的(82.55±33.47)μmol/L 降至(54.23±26.19)μmol/L，高原缺氧引起的血清NO 合成分泌降低与快速进入高原者进入高原后的肺动脉高压及急性高原反应的发生密切相关。马勇等也研究发现初入海拔5380 m居住10d，血浆NO 含量的急骤下降则可能是舒缩血管因子低氧性平衡失调、肺动脉血管收缩、肺动脉压力改变所致，导致急性高原病易感[31]。有学者报道低氧可降低兔离体肺组织中NO，并引起肺血管收缩的现象，提示高原地区NO 含量降低可能是高原地区缺氧性肺血管收缩反应发生的原因[3233]。高原肺动脉高压是一种血管性反应并且与保持肺血管舒张的NO 水平密切相关[34]。高原肺水肿发病的根本原因是缺氧导致肺血管收缩增强，肺动脉压急剧升高。1个在平原地区的健康人在4559 m停留20h时，肺动脉收缩压增加了13 mmHg;高原肺水肿患者则增加了2倍多(27 mmHg)[35]。因此，NO 可以通过血管扩张，抵消缺氧性肺血管收缩，当高原肺水肿患者吸入混有15～40ppm NO 的气体15～40 min 时，都能降低肺动脉压[35]，因而吸入NO 可以应用于高原肺水肿的治疗过程当中[12]。此后还有大量研究表明体内不同形式和不同部位的NO，在氧气从肺运输到心血管、血液和线粒体的各级梯度中发挥着重要的作用[3639]。对于高原肺水肿患者的NO 含量降低，是否与NOS3基因(该基因编码eNOS)多态性相关还存在争议，有的学者研究报道NOS3 基因G894T(Glu298Asp)多态性与高原肺水肿的易感性相关，然而另有学者报道该位点的多态性与HAPE 的易感性不相关[4044]。急性高原反应的发生也与NO 含量密切相关，Macinnis等[45]报道在急性高原反应患者中呼出气NO 的浓度低于健康对照组。Wang等[46]通过研究NOS3基因G894T 多态性与急性高原反应的易感性，发现基因型NOS3894T 在急性高原反应中发病率显著高于对照组，是急性高原反应的危险因素之一。研究表明在暴露于高原的前20h血管内血浆NO2- 、RSNO、动脉和静脉血液中红细胞NO 的水平都发生了明显的改变，而且在高原地区红细胞中氮氧化物约占动脉总NO 的22%，而在平原地区只占了11%[34]。因而红细胞相关NO 可以导致血管扩张、增加血流量和提高氧运输，提示NO 在高原适应时的重要作用。有报道在印度3400m 和在秘鲁4350m的高原居民和土著人的循环氮氧化物水平有一个小到大的增加，并且发现了在4200m 藏族人的红细胞相关氮氧化物比低海拔地区平原人高了200倍，而且他们的尿硝酸盐与美国平原人群相比有10 倍的增加[23]。通过测定藏族人尿中氮氧化物定量，发现他们全身NO 含量是高于平原人群的，这与肺中总量NO 和氮氧化物的测量结果是一致的，即肺中总量NO 和氮氧化物在藏族人中也同样是高于平原人的，这表明了机体内有更多的NO 合成[47]。这些变化可能是由于遗传变异，Wang等[48]研究NOS3基因的G894T 多态性与高原适应的相关性，发现安第斯高原世居人口中等位基因G 的频率显著高原居住在平原的印第安人人群，提示NOS3894G 基因型可以提高NO 的含量，促进高原习服和适应。

5　结论与展望大量研究已明确，高水平NO 与在高原地区机体的功能改善和预防疾病是相关的。然而许多关键问题仍然需要得到解决，例如：成功高原习服的平原人的NO 是否仍然升高，这种升高是否是短暂的，NO 是否只是对高原环境的一种早期反应而不能维持。同样，还需要了解当藏族人在平原地区无缺氧条件时，他们在高原上的高水平NO 是否继续保持。

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(收稿日期：20120917)