WARM 试剂在温性自身免疫性溶血性贫血中的应用

自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是指由于自身红细胞膜分子构象改变、免疫系统功能异常或某些遗传因素等，产生自身抗体和(或)补体结合在红细胞膜上，导致红细胞破坏加速而引起的一组溶血性贫血疾病[1]。根据自身抗体的血清学特点可分为：温抗体型、冷抗体型、混合型，含温自身抗体的标本，因红细胞被致敏，血浆中存在自身抗体，无论是血清学检测还是临床的配合性试验，都是非常棘手的问题，常常困扰着输血工作者，如何提高对此类疑难的标本快速的处理能力，找到相合的血液为患者输注是输血工作者的急需解决的首要问题。笔者在实际工作中采用WARM(warmautoantibodyremovalmedium)试剂快速解决了1例自身免疫溶血性贫血患者交叉配血问题，并对WARM 试剂在AIHA 患者中的应用进行了可行性的探讨，现报道如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料　患者，女，42 岁，有严重的肺部感染，因家庭经济困难，在家中自行买药服用，近期病情严重住院进行治疗，因同时伴有严重的贫血需输血治疗在交叉配血时出现主次侧均有较强的凝集反应，采集血样标本送至本中心输血研究所血型参比实验室进行交叉配血。

1.2　主要试剂　抗A、抗B(lot：20110304)、抗C(lot：20113001)、抗c(lot：20113101)、抗E(lot：20123201)、谱细胞(lot：20125703)、抗人球蛋白试剂IgG(lot：20120117)和C3(lot：20100901)由上海血液生物提供，抗D(lot：2135070)由Biotest公司提供，抗S(lot：TJH1002C)由Millipore公司提供，凝聚胺试剂(lot：20120201)由长春博德提供，WARM 试剂(lot：wm045)由美国IMMUCOR 公司生产，ABO 型混合红细胞试剂由实验室新鲜配制。

1.3　方法

1.3.1　ABO、Rh 血型检测　采用直接抗人球蛋白实验(DAT)、间接抗人球蛋白试验(IAT)，抗体筛查及鉴定和热放散实验均按《全国临床检验操作规程》[2]和试剂说明书进行。

1.3.2　WARM 放散吸收方法　(1)1 支WARM 试剂加入5国际检验医学杂志2013年1月第34卷第2期　IntJLabMed，January2013，Vol.34，No.2 ·215· mL 去离子水，彻底混匀。(2)加1体积患者压积红细胞，再加入2体积的WARM 试剂悬液。置于(37±2)℃孵育30min后离心将放散液转移至1支新试管中备用。(3)将放散后的患者红细胞用生理盐水至少洗涤3 次后，取少量压积红细胞配成5%的悬液，做直接抗球蛋白实验，记录凝集强度，检测自身抗体放散效果，如果凝集强度为1+或更低，进入下一步骤，否则需重复前面2 个步骤，直到凝集强度为1+ 或更低。(4)将WARM 试剂放散洗涤后的压积红细胞，加入等量患者血清或血浆，混合后于(37±2)℃ 孵育30～60 min 进行自身吸收。(5)离心后收集吸收后血清，在(37±2)℃用抗球蛋白方法检测与自身细胞凝集强度，并检测自身抗体吸收效果。

2　结　　果

2.1　血型检测及DAT 结果　患者代某的血型为A，CcDee。患者DAT 结果：IgG3+;C33+;WARM 试剂1 次放散后IgG ±。见表1。

2.2　抗体鉴定结果　未处理的患者血清、患者红细胞放散液与用WARM 试剂吸收后的患者血清分别与谱细胞和自身细胞进行抗体鉴定。未处理的患者血清与谱细胞有反应但无特异性;放散液无抗体反应特异性，用WARM 试剂处理后的患者的血清进行抗体筛查与鉴定结果显示患者的血清中有IgG抗S抗体的存在，见表2。

表1　　患者血型检测与DAT 结果标本抗A 抗B 抗C 抗c 抗D 抗E 抗S AC BC OC 自身C DAT(IgG) DAT(C3)

未处理血清" " " " " " " - 2+ - 1+ " " 

未处理红细胞4+ - 3+ 4+ 4+ - 1+ " " " " 3+ 3+

WARM 处理红细胞3+ - 2+ 3+ 3+ - 1+ " " " " ± " 

热放散处理红细胞3+ - 2+ 3+ 3+ - - " " " " - " 　　

表2　　不同类的标本抗体鉴定结果谱细胞未处理血清标本立即离心2次离心IAT(试管)WARM 试剂处理的红细胞放散液立即离心2次离心IAT(试管)WARM 试剂处理后的血清标本立即离心2次离心IAT(试管)

1号(CCDee，S+) - - 1+ - - - - - 2+

2号(ccDEE，S-) - - ± - - - - - -

3号(CcDEe，S-) - - ± - - - - - -

4号(CcDEe，S-) - - ± - - - - - -

5号(ccDEe，S-) - - ± - - - - - -

6号(ccDee，S-) - - 1+ - - - - - -

7号(ccdee，S-) - - ± - - - - - -

8号(CCDEe，S-) - - ± - - - - - -

9号(ccdee，S-) - - ± - - - - - -

10号(ccDEE，S+) - - ± - - - - - 2+

自身c(CcDee，S-) 1+ 1+ 2+ / / / 1+ 1+ ± 　

2.3　进一步的抗体确认实验结果　用抗S 试剂血清从5 个表型为CCDee献血者中筛选出2个S抗原阳性的细胞和3个S抗原阴性细胞进一步检测患者吸收后的血清，结果显示WARM 试剂吸收后的血清与2 个S抗原阳性细胞凝集，而不与3个S抗原阴性细胞发生凝集，见表3。用WARM 试剂放散实验结果为±的患者进行S抗原的检测，结果显示为S抗原为阳性，为进一步确认患者的S抗原，采用热放散技术处理患者的红细胞为DAT 阴性后进行S抗原的检测，为保证检测的有效，同时加做了患者D 抗原的检测作为阳性对照，E 抗原的检测作为阴性对照，结果显示患者的S抗原为阴性。

表3　　进一步抗体确认实验结果方法1号细胞(A，CCDee，S-) 2号细胞(A，CCDee，S+) 3号细胞(A，CCDee，S-) 4号细胞(A，CCDee，S-) 5号细胞(A，CCDee，S+)

盐水法- - - - -

IAT(试管法) - 3+ - - 3+

2.4　交叉配血　选择A，CCDee，S阴性的献血者血样400mL和WARM 试剂处理后的血清标本，采用盐水法、聚凝胺法和抗人球蛋白试管法进行主侧配血，结果均阴性反应。

3　讨　　论

AIHA 患者的输血原则是能不输血尽量不要输血，主要原因就是因为患者体内自身抗体的存在会掩盖同种抗体，使同种抗体检测困难，从而导致严重的输血反应[3]。对AIHA 患者进行交叉配血时，需要考虑的最重要的问题也是患者血清中是否有同种抗体的存在。为保证同种抗体的检出，必须用自身吸收的方法除去自身抗体的干扰来确定同种抗体的存在。但由 ·216· 国际检验医学杂志2013年1月第34卷第2期　IntJLabMed，January2013，Vol.34，No.2于患者红细胞上的抗原位点被封闭，有必要先从红细胞上洗脱自身抗体，使抗原位点暴露利于自身抗体的吸收，一旦自身抗体除去，就可检测吸收后血清中的同种抗体特异性[4]。目前用于红细胞放散方法有很多种，包括热放散、磷酸氯喹放散、WARM 试剂放散、乙醚放散等方法，各种方法均具有优缺点。热放散方法操作简便，放散能力和吸收能力并不显著，但不改变红细胞抗原，利于自身放散后确定ABO/RH 血型[4]，此例AIHA 患者的血型鉴定也印证了这一点;磷酸氯喹放散方法的放散能力和吸收能力中等，时间较长，不破坏红细胞完整性，可以用于抗球蛋白试验检测血型及用于自身吸收试验，但放散液不能用于抗体的鉴定[57];乙醚放散方法对细胞破坏较严重，主要用于得到红细胞放散液来分析致敏的自身抗体和(或)同种抗体的特异性[8];而WARM 试剂放散法是以ZZAP试剂(主要成分是二巯基苏糖醇和被半胱氨酸激活的木瓜酶)为基础，在解离抗体的同时，通过蛋白水解酶处理自身红细胞可增强其吸收自身抗体的能力，提高吸附量，放散能力和吸收能力最佳[4]。笔者对本例患者采用WARM 试剂来进行自身抗体的放散和吸收，结果显示WARM 试剂在对直抗IgG 强阳性(3+)红细胞的放散能力很强，时间短，仅需30 min 左右，同时用WARM 试剂处理后的红细胞与自身血清进行吸收，吸收后血清自身对照为±，说明自身抗体吸收效果比较明显，这与苏宇清等[4]报道相一致;对吸收前后的血清用谱细胞检测，谱细胞的反应格局由无特异性抗体格局变成明显可见的IgG 抗S抗体的反应格局，这也印证了自身抗体的存在会掩盖同种抗体;但是笔者在对抗S抗体进行进一步确认时发现WARM 试剂处理后红细胞抗原反应敏感性增强，出现假阳性的情况，可能是由于WARM 试剂中的木瓜酶对抗原有修饰作用，增强Rh血型系统抗原的检出率，红细胞MN 和Dully系统抗原被酶破坏，同时WARM 试剂中的二巯基苏糖醇会导致某些抗原变性，如Kell、Lw 血型抗原[910]，因此笔者认为经过WARM 试剂处理的红细胞可能不适用于ABO 及Rh血型系统外的其他血型系统的血型鉴定，但还需要更多实验数据的支持。为保证临床输血安全、有效，通过WARM 试剂的应用分析，笔者认为对直接和(或)间接抗IgG 阳性的细胞，可以采用WARM 试剂和热放散联合使用，快速了解患者体内是否存在同种抗体，并确定同种抗体的特异性，为患者能得到及时有效的治疗节约宝贵的时间。参考文献

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(收稿日期：20120708)