新加越鞠丸对非酒精性脂肪肝大鼠脂联素及瘦素影响的实验研究

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种肝组织病理学改变与酒精性肝病相类似但无过量饮酒史的临床综合征。目前普遍认为其发病机制与脂质代谢紊乱、氧化应激和脂肪细胞因子失调等因素有关[1]。脂联素(ADP)、瘦素(LP)是脂肪细胞分泌的细胞因子,它们分泌的异常与脂肪肝的形成及发展密切相关。中医学理论认为,脂肪肝的病机与痰、湿、瘀、积有关,肝失疏泄,脾失健运,湿邪内生,痰浊内蕴等导致肝脾功能失调,湿痰瘀互结于肝而致。新加越鞠丸是在治郁名方越鞠丸基础上进行加减而来,针对性治疗脂肪肝的病因病机,临床应用有较好的疗效。本文旨在通过建立非酒精性脂肪肝大鼠模型,来研究新加越鞠丸对非酒精性脂肪肝肝脂联素、瘦素的影响,用以探讨新加越鞠丸治疗非酒精性脂肪肝的作用机理。

材料和方法

一、实验材料

1.实验动物:健康雄性SD大鼠共35只,体重180~2OOg,山东鲁抗医药集团有限公司提供,动物合格证号:SLⅩK2008OOⅡ。

2.主要药物及试剂:越鞠丸方药组成:川芎12g,香附12g,神曲12g,白术12g,莪术9g,虎杖9g,草决明9g,共7味中药,制成2.3g(生药)·mL-1的水煎液(由青岛市传染病医院药剂室制作);水飞蓟宾胶囊(水林佳,天津天士力制药股份有限公司生产),每粒含水飞蓟宾35mg,按照22mg·kg-1·d-1剂量,临用前用适量蒸馏水配成混悬液;胆固醇(郑州市和茂商贸有限责任公司);大鼠脂联素(ADP)ELISA试剂盒(由上海研域化学试剂有限公司提供);瘦素放射免疫试剂盒(由上海源叶生物科技有限公司提供)。

二、实验方法

1.动物模型制各:大鼠适应性喂养I周后,从35只大鼠中随机选取冗只大鼠进行造模,喂高脂饲料[2](配方:基础饲料88%、猪油10%、胆固醇2%),其余9只大鼠为正常对照组,喂普通饲料。8周后,从模型组随机选取2只大鼠处死,从正常对照组随机选取1只大鼠处死,分别取相同部位肝组织,HE染色后,光镜下观察肝组织病理变化,以《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[3]为诊断标准确定造模成功。

2.分组给药:将造模成功的以只大鼠,随机分为三组,每组8只,分别为模型对照组、新加越鞠丸组、水林佳组,未造模的8只大鼠为正常对照组。四组大鼠均喂普通饲料,自由饮水。同时新加越鞠丸组每只大鼠每次给予2mL新加越鞠丸煎液灌胃,水林佳组每只大鼠每次给予2mL水林佳混悬液灌胃,正常对照组和模型对照组每只大鼠分别灌胃2mL生理盐水,每日都为2次,持续4周。实验第⒓周末末次给药后禁食12h,以10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,心脏取血,低温离心,取血清,-⒛℃保存,待用于生化指标及血清脂联素、瘦素检测。

3.检测指标:血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST),采用日本0LYMPUS,AU27OO全自动生化分析仪测定;血清ADP采用酶联免疫吸附法检测;血清LP采用放射免疫分析法测定。三、统计学处理采用SPSS16.0统计软件对结果进行分析。所得实验数据以均数±标准差(x±s)表示,行正态性检验和方差齐性检验,若正态分布、方差齐性,则采用单因素方差分析,多组数据间的两两比较采用"D法;若方差不齐,则采用多重秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.一般情况:在12周实验过程中,各组大鼠生长良好,体重呈进行性增长。正常对照组大鼠毛发光泽,行动敏捷,饮食、二便正常。其他各组大鼠造模前2周食欲旺盛,体重增长迅速,随着造模时间也延长,大鼠毛发变黄,反应迟缓,食欲下降,大便偏稀,体重增加变慢,给予药物干预后,大鼠食欲及大便稀等情况有所改善。纳人实验的35只大鼠未出现死亡。

2.新加越鞠丸对大鼠血脂的影响:与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清TG、TC均明显升高(P<0.05),显示NAFLD大鼠存在着明显的脂质代谢紊乱。药物干预后,各治疗组均能明显降低模型大鼠血清TG、TC含量(P<0,O~s),其中,新加越鞠丸组优于水林佳组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

3.新加越鞠丸对大鼠血清ALT、AST的影响:与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清ALT、AS均明显升高(P<0.05);与模型对照组比较,新加越鞠丸组、水林佳组大鼠血清ALT、AST含量均明显降低(P<0.05),但都未恢复到正常水平。其中,新加越鞠丸组优于水林佳组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

4.新加越鞠丸对大鼠血清ADP的影响:与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清ADP明显降低(P<0.05);与模型对照组比较,新加越鞠丸组、水林佳组大鼠血清ADP均明显升高(P<0.05),但仍低于正常对照组。与水林佳组比较,新加越鞠丸组大鼠血清ADP升高优于水林佳组,差异有统计学意义(P<0.05),结果见表3。

5.新加越鞠丸对大鼠血清LP的影响:与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清LP明显升高(P<0.05);与模型对照组比较,新加越鞠丸组、水林佳组均能显著降低大鼠血清LP含量(P<0.05),但都仍未恢复正常水平。在降低血清LP含量方面,新加越鞠丸组优于水林佳组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),结果见表3。

讨论

中医理论认为脂肪肝可归属于“瘀证”“痰证”“积证”“肥气”等范畴,肝气主升、主动,性喜条达而恶抑郁,肝失疏泄、脾失健运乃本病病机之一,进而可致痰湿内生,气机郁滞,最终导致痰湿瘀积互结于肝。其病因主要与饮食不节,起居无常,情志失调和禀赋异常有关。新加越鞠丸就是针对其痰湿瘀积的病机,在越鞠丸基础上加减而来。元代朱丹溪提出:“气郁、血郁、火郁、食郁、湿郁、痰郁”六郁之说,认为:“气血冲和,万病不生,一有怫郁,诸病生焉。故人身诸病多生于郁。”(《丹溪心法·六郁》),而创制越鞠丸这一名方,全方由香附、川芎、苍术、神曲、栀子五味药组成,针对六郁病机。但根据脂肪肝患者的临床表现及体征,很少见到火郁证候,故减去栀子;苍术偏于走表而除表湿,而脂肪肝病机皆因脾失健运而生内湿,故以白术代苍术。并结合现在药理研究加人保肝、调脂中药而成新加越鞠丸方,其方由香附、川芎、白术、神曲、莪术、虎杖、草决明七味药组成,其中香附辛香入肝,行气解郁为君药;丿刂芎辛温人肝胆,为血中气药,既可活血祛瘀,又可助香附行气解郁;白术甘温,燥湿健脾益气,以除体内湿邪;神曲味甘性温人脾胃,消食导滞,三药共为臣药;莪术辛温入肝脾,破血行气消积,其所含莪术油有明显的保肝及抗组织纤维化作用;虎杖苦微寒人肝,清热利湿,散瘀止痛,还具有降血脂、护肝作用[4];草决明甘微寒人肝,清肝明目,现代研究认为[5]其具有降低血浆总胆固醇和甘油三酯的作用,三药共为佐药,以加强君臣药作用。上述各味药搭配,重在调理中焦气机,具有疏肝理气,利湿化痰健脾,化瘀行滞的功效,以达治病求本之目的。

脂联素(ADP)是由脂肪细胞分泌的一种脂源性激素,也是一种重要的代谢性细胞因子。ADP在正常人血浆中大量表达,其在调节能量平衡、胰岛素敏感性以及抗动脉硬化等方面作用突出。ADP缺乏或低ADP血症与胰岛素抵抗(IR)、肥胖症、2型糖尿病以及动脉硬化等关系密切。研究发现,ADP可激活AMP激酶和PPARγ途径,通过增加肝细胞脂肪酸的β氧化并减少其合成,以及抑制葡萄糖的产生,从而降低细胞内甘油三酯和糖原含量,改善胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱,且与脂肪肝的发病呈负相关[6]。从本实验的结果可看出,模型对照组大鼠血清ADP较正常对照组明显降低,说明经高脂饮食诱导的大鼠模型已存在促氧化物质与抗氧化物质之间的动态平衡失调,处于脂质过氧化状态。运用药物干预后,大鼠血清ADP含量显著升高,且新加越鞠丸组优于水林佳组,提示机体抗脂质过氧化的作用得到改善,以中药组更为明显。

瘦素(LP)是由肥胖基因编码的一种蛋白质激素,主要有脂肪细胞分泌。可通过血脑屏障作用于下丘脑的体重调节中枢,或直接作用于靶细胞的LP受体,参与调节机体摄食行为及能量平衡,具有抑制食欲、减少三酰甘油合成、促进脂肪氧化、防止脂毒性、减轻体质量、调节内分泌等作用。当人体LP及其受体分泌减少或发生变异均可导致进食过度以及脂肪代谢异常。有研究[7]认为脂肪肝与瘦素、胰岛素抵抗及高胰岛素血症密切相关,报道显示部分NAFLD患者血清瘦素明显升高,提示该部分患者体内可能存在瘦素抵抗,高瘦素水平和瘦素抵抗可以提高胰岛素水平,促进胰岛素抵抗,从而影响肝细胞的胰岛素信号传导通路,导致肝细胞内脂肪酸含量升高,最终引发脂肪性肝病。有临床研究[:]发现,NAFLD患者存在高血清瘦素水平,且与肝脂肪变程度呈正相关。本次研究显示,模型对照组大鼠血清瘦素水平明显高于正常对照组,提示NAFLD大鼠体内出现了瘦素抵抗,导致其不能发挥正常的生理效应。新加越鞠丸组和水林佳组大鼠血清瘦素水平明显低于模型对照组,且新加越鞠丸组优于水林佳组,但都未恢复到正常水平,可能与用药时间短有关。由此推测,新加越鞠丸可有效降低NAFLD大鼠的血清瘦素水平。综上所述,本实验通过观察新加越鞠丸对NAFLD大鼠血清ADP和LP的影响,结果显示新加越鞠丸可有效升高血清ADP水平,降低血清LP水平,以此来减轻多因素导致的肝损伤,可能为该方治疗非酒精性脂肪肝的作用机理。其详尽的作用机理有待深人研究。

4 参考文献

[1]Malaguarnera M,Di RosaM,Nicoletti F. Molecular mechanisms involved in NAFLD progression[J].Journal ofMolecular Medicine,2009,(07):679-695.

[2]孙志,张中成,刘志诚. 营养性肥胖动物模型的实验研究[J].中国药理学通报,2002,(04):466-467.

[3]范建高. 非酒精性脂肪性肝病诊疗指南[J].现代医药卫生,2011,(05):641-644.

[4]李菁雯,陈祥龙,孟祥智. 虎杖及其提取物的研究进展[J].中医药学报,2011,(03):103-106.

[5]刘爽,李文妍,肖云峰. 草决明药理作用的研究[J].北方药学,2011,(12):12,27.

[6]Yamauchi T,Kamon J,Waki H. Thefat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated withboth lipoatrophy and obesity[J].Nature Medicine,2001,(08):941-946.

[7]曾民德. 非酒精性脂肪肝病研究的关切点[J].肝脏,2009,(04):321-324.

[8]范建高,曾民德. 脂肪性肝病[M].北京:人民卫生出版社,2005.139-140.