高效液相法测定人血清中硫酸头孢噻利
发表时间：2014-03-10 浏览次数：686次
硫酸头孢噻利是第4代注射用头孢菌素,蛋白结合率为11.8%~17.6%,主要以原形从肾脏排泄,24h尿中排泄率为99%以上,消除半衰期约为2~2.3h,其不良反应较少,一般有过敏、休克、痉挛及意识障碍、急性肾功能不全、血小板减少等[1]。本文拟建立一种灵敏,可靠的测定人血清头孢噻利浓度方法。
材料与方法
1 药品与仪器
硫酸头孢噻利对照品,纯度83.2%;内标(IS):头孢吡肟对照品,纯度83.5%,均购自中国药品生物制品检定所。
12OO高效液相色谱仪,美国Agilent公司产品。
2 色谱条件[2]
前置柱为ZORBAX EP-C18柱(4.6mm×15mm,5um);色谱柱为ODYSSIL-C18柱(4.6mm×250mm,5um);流动相为20mmol·L-1KH2P04-甲醇(86.5:13.5);流速为1mL·min-1进样量为30uL;柱温为30℃;检测波长为254nm。
3 溶液配制
称取硫酸头孢噻利30.05mg,相当于头孢噻利25mg,置于25mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得1mg·mL-1储各液,放置于4℃冰箱冷藏保存。取该储备液以甲醇倍比稀释,配成硫酸头孢噻利系列标准溶液,取空白血清200uL,加人硫酸头孢噻利系列标准液50uL,配成相当于血清浓度为250,1OO,5O,20,5,2.5,1.0ug·mL-1的血清样品,-20℃保存备用。
4 样品处理方法
吸取融化血清样品200uL于洁净1.5mLEP管中,加入100ug·mL-1头孢吡肟内标储各液50uL,空白甲醇5OuL,最后加入5%高氯酸水溶液200uL,涡旋混匀1min,在4℃,14000r·min-1下离心10min,取上清液3OuL进样分析。
结果
1 专属性
在样品测定条件下,空白血浆和血浆+内标,处理后,样品和内标保留时间分别为11.0,8.0而n,无干扰,本方法专属性良好。
2 标准曲线和定量下限
取空白血清200uL加人硫酸头孢噻利系列标准液50uL,相当于血清药物浓度1.0,2.5,5,20,50,10O,250ug·mL-1的血清样品,除不补加甲醇50uL,其余步骤按“样品处理方法”操作,取30uL进样分析,求得标准曲线回归方程为y=4.81X+0.28×10-2(r=0.9999),线性范围为1~250ug·mL-1,定量下限为1ug·mL-1。
3 精密度和回收率
分别配制浓度为2.5,20.0,200.0ug·mL-1的血清样品作为质控(QC)样品,按“样品处理方法”操作,每浓度6样本,连续测定3d,根据当日的标准曲线测定QC样品浓度,计算日内,日间RSD,结果见表1。
取空白血清200uL,加入内标头孢吡肟5O uL(1OO ug·mLˉ1)和5%高氯酸水溶液200uL,涡旋震荡1min,再加入系列标准液5Q uL(2·5,20,200ug·mLˉl)涡旋混匀1min,14OO0r·min1离心10min,每浓度3样本,得到相应峰面积,与当日相应浓度的质控(QC)样本的峰面积比较,计算绝对回收率,见表1。
4 稳定性
制备硫酸头孢噻利高,中,低3个浓度(200,20和2·5ug·mL-1)的血清样品分别在室温放置4h、-80℃反复冻融3次,结果表明样品在上述条件下均稳定(RE<7.57%)。
5 稀释效应
配制硫酸头孢噻利400,40,5ug·mL-1 3个浓度的血清溶液,用血清稀释2倍,配制为200,20和2.5ug·mL-l的硫酸头孢噻利血清溶液,按照“样品处理方法”配制的相同浓度的待测物,进行3样本分析,结果其RE均<8.38%,RSD均<3.01%.
讨论
本文参考文献报道[3],建立了测定人血清中头孢噻利浓度的HPLC法,用直接沉淀蛋白处理血清样品,该法灵敏度高,操作简便,分离良好,峰形对称。本试验未用以往文献报道氮吹法[4，5]处理样品,而用高氯酸直接沉淀法,并且利用前置柱过滤样品中大粒径的物质,高氯酸沉淀能力强,血清被稀释的倍数较小,可保证达到测定所需的定量下限。血清处理方法,减少了定量操作的步骤,使定量更准确,血清处理更方便,处理效率更高,成本较低,大大提高实际测定样品浓度的实用性。
参考文献
[1]Ohtaki K,Matsubara K,Fujimaru S. Cefoselis,a beta-lactam antibiotic,easily penetrates the blood-brain barrier and causes seizure independently by glutamate release[J].Journal of Neural Transmission,2004.1523-1535.
[2]卢协勤,张根元. 高效液相色谱法测定注射用头孢噻利的含量[J].抗感染药学,2007.169-171.
[3]邱枫,肇丽梅,孙亚欣. 单剂量静脉滴注硫酸头孢噻利在中国健康志愿者的药代动力学[J].中国临床药理学杂志,2009.207-210.
[4]陈漪,金米聪. 液相色谱-串联质谱法测定血清中硫酸头孢噻利浓度[J].中国药师,2010.37-40.
[5]陈漪. HPLC法测定血清中硫酸头孢噻利浓度[J].中国临床药理学杂志,2010.153-156.
