革兰阴性菌挥发性有机物的检测与分析
发表时间：2014-03-28 浏览次数：1217次
肺部感染是临床常见病、多发病,在感染性疾病死因中位居第一位。引起肺部感染的细菌种类复杂,临床上常难以做出快速诊断,是否能针对病原菌及时正确的选择抗菌药物是直接影响患者预后的主要因素。不同种类细菌生长时会产生不同的代谢产物,代谢产物包含有一些挥发性有机物(VOCs),通过这些挥发性有机物的检测分析可达到鉴别菌种的目的。本研究通过应用固相微萃取及气相色谱/质谱联用技术(SPME+GC/MS)对临床常见革兰阴性菌培养产生的上层气体进行检测,比较革兰阴性菌各菌种产生的VOCS成分差异,达到鉴别细菌菌种的目的,为进一步探讨SPME+GC/MS检测人呼出气VOCs在肺部感染细菌诊断中的应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 肺炎克雷伯菌6株[标准株2株,ESBL(+)临床分离株2株,ESBL(—)临床分离株2株];大肠埃希菌6株[标准株2株,ESBL(+)临床分离株2株,ESBL(-)临床分离株2株];铜绿假单胞菌6株(标准株2株,临床分离株茌株),鲍曼不动杆菌6株(标准株2株,临床分离株4株),嗜麦芽假单胞(标准株2株,临床分离株4株)。
1.2 主要仪器 0.45%盐水(Biomerieux Inc,批号:g084103)血培养基、血液增菌培养液(杭州天和微生物试剂有限公司);磁搅拌子;恒温恒湿箱(上海精宏实验设各有限公司)、比浊测定仪(VITEK DENCHEK);双相血培养瓶(梅里埃公司);气一质联用仪(美国Voyager GC/Ms),SPME手柄;75um CAR/PDMSSPME萃取头;毛细管柱(INNOWAC30um×0.25um×0.25um)。
1.3 方法 (1)细菌的增殖培养:刮取培养基上生长的菌落,制成1.0McFadand混悬液。用注射器取3mL1.0McFar1and混悬液注人已标记菌种的双相血培养瓶内,同时将生理盐水3 mL注人培养瓶中作为空白对照。血培养瓶放人恒温恒湿箱中培养24h。(2)萃取细菌培养瓶上层气体及进样检测:细菌培养液用磁力搅拌子中速搅拌,将SPME纤维针头插人标本中萃取培养瓶上层气体,在室温下萃取30min后立即进人GC/MS进样口检测。GC/Ms条件为HP25MS石英毛细管柱·载气为He,流速1.0mL/mln,进样口温度250c;程序升温:起始50C,保持2min,再以8℃/min升温至180C,再以10℃/min升温至240·C,保持5min;GC/MS接口温度280C;质谱扫描范围35~550u;离子源:EI源;电子能量:70eV;谱图检索:采用Wiley2713和Nist98谱库进行检索。
2 结果
肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌共能检测出13种VOCs,两种细菌共有的VOCs包括乙醇、⒈葵醇、1-十二醇、顺式9一十六碳单烯酸、⒈十六醇等物质,标准株与临床株之间有一定差异性,⒊甲基△一丁醇只在肺炎克雷伯菌中检出,乙酸、吲哚只在大肠埃希菌检出,铜绿假单胞、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽假单胞类非发酵菌则检测不到VOCs,见表1。
3 讨论
随着萃取及气相色谱/质谱技术的进步,近年来将该检测方法应用于呼出气疾病诊断的研究报道层出不穷,研究范围涵盖了肺癌[l-5]、乳腺癌[6-7]、肝癌[8]等肿瘤性疾病和哮喘、慢性阻塞性肺病[9-10]等气道炎症性疾病,也涉及了器官移植排斥、心绞痛、肾功能不全等疾病[11-14]。2007年Phillips等[15]通过气相色谱/质谱法检测体外培养结核菌的上层气体,分析出萘、1-甲基环己烷、庚烷等结核菌产生的特异性VOCs,随后收集患者呼出气体进行气相色谱/质谱检测,应用该特异性气体来诊断肺结核敏感性为82.6%,特异性为100%。挥发性有机物检测在其他细菌感染中的应用国内外文献尚未见报道。
本研究以临床常见革兰阴性杆菌为研究对象,收集细菌培养的上层气体通过SPME+GC/MS技术进行检测,最终发现肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌的V○Cs中普遍存在乙醇、⒈葵醇、⒈十二醇、顺式9-十六碳单烯酸、1-十六醇等物质,铜绿假单胞、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽假单胞类非发酵菌则检测不到VOCs,因此可明确鉴别发酵菌与非发酵菌。但发酵菌之间鉴别较难,各种发酵菌是否存在其特异性气体尚不确定,如3-甲基-1-丁醇只在肺炎克雷伯菌中检出,乙酸、吲哚只在大肠埃希菌检出,这是否可认为这些VOCs为该细菌的特异性气体仍有待下一步扩大细菌种类及大样本量的研究。
气相色谱/质谱检测有着高选择性、高分离效能、高灵敏度、高速度等特点,在疾病的快速诊断方面有着很大的优势,本实验为进一步探讨气相色谱/质谱检测人呼出气VOCs在肺部感染诊断中的应用提供了良好的实验依据。
