卵巢癌组织中CREB结合蛋白和P53蛋白的表达及其临床意义

卵巢癌是严重威胁生命健康的一种恶性肿瘤,其病理类型比较复杂,发生机制仍不明确。有研究表明,p300/CBP的CH1区域对P53有泛素连接酶活性,p300/CBP通过鼠双微体基因2(muhne double minute2,Mdm2)依赖或非依赖机制、调节P53泛蛋白化作用和降解,有助于控制P53稳定性。CREB结合蛋白(CRE5.bilabcding ploton,CBP)突变后没有正常的功能,可能影响P53的转录。本文采用免疫组化技术检测卵巢癌及正常卵巢组织中CBP(C-20)、CBP(N-22)和P53蛋白的表达,明确CBP突变的位置,探讨三者在卵巢癌的发生与发展中的作用,并分析他们之间的相关程度,为CBP和P53蛋白在卵巢癌发生机理的进一步研究提供了新的思路。

1  资料与方法

1.1 —般资料  收集2004年1月至2011年6月辽宁医学院附属第一医院妇产科卵巢癌手术切除标本67例,患者年龄31~84岁。其中卵巢恶性上皮性肿瘤67例(浆液性囊腺癌19例,黏液性囊腺癌21例,子宫内膜样囊腺癌27例);卵巢正常组织18例。所有患者术前均未接受放、化学或免疫治疗,且均具有完整临床资料。所有标本均经本院病理科确诊。

1.2 标本的处理 组织标本均用磷酸缓冲液配置的10%中性甲醛固定液及时固定后,进行乙醇梯度脱水,二甲苯透明以及石蜡包埋,4um厚连续切片。

1.3 免疫组织化学实验 (l)兔抗人CBP(C-20)、CBP(N-22)多克隆均抗体购自美国Sata cruz公司,兔抗人P53购自北京中杉工作液,SP超敏试剂盒购自北京屮杉生物技术有限公司按试剂盒说明书步骤进行染色,每次试验均设阴性对照,用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照,以公司提供的阳性片染色作为阳性对照。(2)实验结果判断:细胞内呈棕黄色颗粒状为阳性表达,其中CBP(C-20)、CBP(N-22)和P53蛋白阳性表达均定位于细胞核颗粒。免疫组织化学染色结果采取随机观察1O个高倍视野,每个视野计数100个细胞,按照阳性细胞所占百分比与着色强度进行评分:(1)根据阳性细胞所占百分比评分,0分:无阳性细胞;1分:阳性细胞小于或等于10%;2分:阳性细胞10%~40%;3分:阳性细胞大于40%。(2)根据着色强度进行评分:无显色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。取(1×2)项评分的乘积作为染色结果的评判标准:0~2分为阴性,3~9分为阳性表达。观察结果由两名病理科医师采取盲法判断。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析。CBP(N-22)和P53在卵巢癌以及卵巢正常组织中的差异表达采用扌检验,CBP(N-22)和P53表达的差异与病理及临床参数的关系采用x2检验。CBP(N-22)和P53表达的相关性分析采用spearman相关分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 CBP(C-20)、CBP(N-22)和P53在卵巢癌和正常卵巢组织中表达CBP(C-20)、CBP(N-22)和P53蛋白阳性表达均定位于细胞核(图1)。在67例卵巢癌中,CBP(C-20)、CBP(N-22)和P53分别有0例、48例和37例为阳性;在18例正常卵巢组织中,CBP(N-22)和P53分别有0例及2例呈阳性。经独立样本t检验,CBP(N-22)和P53在卵巢癌中的表达明显高于正常卵巢组织(P=0.000,P=0.O0O),CBP(C-20)在卵巢癌中的阳性表达为0,见表1。

2.2  CBP(C-20)、CBP(N-22)和P53蛋白表达与卵巢癌临床病理学参数关系通过x2检验,CBP(N-22)和P53的阳性表达与肿瘤的分期及淋巴转移有关,随着分期的增加,两者的表达明显增高,有淋巴结转移者阳性表达明显高于无转移者,而与年龄、肿瘤的组织学类型、组织的分化程度无明显的相关性,见表2。

2.3 CBP(C-20)、CBP(N-22)和P53三者表达的相关性分析 由于本实验对CBP(C-20)和CBP(N-22)同时染色的目的是明确CBP的突变的位置在氨基端还是羧基端,且结果表明它的突变位点在CBP(C-20),所以CBP(C-20)在卵巢癌组织中的阳性表达为0,因此本实验只分析CBP(N-22)和P53蛋白表达的相关性。在卵巢恶性肿瘤组织中,CBP(N-22)和P53蛋白表达呈显著的正相关(r=0.432,P=0.000),见表3。

3  讨论

CBP是组蛋白转移酶(HATs)的转录因子家族成员之一,可广泛参与一系列基因的激活[1],参与细胞周期素依赖,细胞周期阻滞及细胞凋亡。在细胞周期调控、能量代谢、细胞分化和细胞凋亡等多种生理过程中发挥着重要作用。在CBP与癌症的关系上,有论据支持CBP是肿瘤抑制子[2],也有研究表明,在早期上皮细胞癌中过度表达CBP[3]。既然CBP可作为原癌蛋白抑制肿瘤,也可有异常活化,为诱导肿瘤的癌蛋白,推测可能是CBP突变的原因。目前有许多研究表明,多种肿瘤中存在P300/CBP的基因突变,在胃癌、结肠癌胰腺癌和乳腺癌中,P300/CBP可发生多种形式的基因变异[4],但不确定是羧基端还是氨基端。

P53是细胞中重要的肿瘤抑制因子,当机体处在不同应激条件下,具有广泛的抗增殖效应,包括生长停滞、凋亡和细胞衰老。突变型P53不仅失去了正常的抑癌作用,而且还促进恶性转化。在所有的恶性肿瘤中,接近50%伴有P53基因的突变,在那些没有P53基因突变的恶性肿瘤中,大部分是通过另外一种机制使P53失活[5]。

CBP作为一种重要的转录辅激活子,能够与多种转录因子结合、相互作用,与转录装置一起参与多种信号的传导。有研究表明,P300/CBP的CH1区域对P53有泛素连接酶活性,P300/CBP通过Mdm2依赖或非依赖机制、调节P53泛蛋白化作用和降解,有助于控制P53稳定性[4]。CBP突变后没有正常的功能,可能影响P53的转录。为了进一步证实此推测,本实验通过免疫组化分别对CBP(C-20)、CBP(N-22)进行染色以判断他们是否都发生突变,以及突变的位置和频率并分析CBP和P53蛋白之间的表达是否有相关性。

本实验研究结果表明,在卵巢癌组织中,CBP(N-22)的表达明显高于正常组织,而CBP(C-20)在卵巢癌组织中的的表达均为阴性,提示CBP突变的位置可能在CBP(C-20),且本实验发现,CBP(N-22)的表达与分期及淋巴转移有关,也有研究表明,在直肠癌中,CBP的表达与肿瘤的组织分型及分期有关[7],与本研究结果一致,提示CBP突变后在卵巢癌的进展中具有重要的作用。

P53分为野生型和突变型,野生型P53(Wtp53)是转录调节因子,其在细胞DNA合成、修复和凋亡调节过程中起重要作用。由于野生型P53蛋白的半衰期短并且含量低微,因此通过免疫组化染色方法难以检测到。当P53突变后,突变P53可与细胞中的某些蛋白结合而积聚在细胞中,在这种情况下则可通过免疫组化方法检测到高水平的突变P53表达[8]。

众多免疫组化研究结果均表明,在恶性肿瘤中,P53的表达均比正常组织明显增高,如卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌[9-12]。P53的表达与临床意义之间的关系一直存在争议。但大部分研究结果均表明,在恶性肿瘤中,P"的表达与分期有关,在浆液性卵巢癌,随着分期和分级的增加,P53的表达增强[9]。在浆液性卵巢癌中,在分级和分期较高的肿瘤中,P53的表达明显增强[10]。在子宫内膜癌中,突变性P53的表达和患者的年龄、分期有关[ll]。但也有研究表明,在浆液性卵巢癌中,随着肿瘤分级的增高,P53的表达水平增高[12]。P53的表达与组织类型有关,浆液性卵巢癌中P53的表达明显高于透明细胞癌[13]。而本研究表明,在卵巢癌组织中,P53的表达明显高于正常组织,且随着分期的增加,P53的表达明显增加,且有淋巴转移者,P53的表达明显高于无转移者。这表明P53可能是肿瘤生物性侵人进展的重要标志。

综上所述,与卵巢正常组织相比,卵巢癌中CBP和P53的表达均明显增高。二者均与分期及淋巴转移有关,且二者的表达呈显著正相关,提示CBP突变后可能影响P53信号转导途径,因此抑制CBP有望成为卵巢癌治疗的靶点。

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