实验研究肝性脑病大鼠海马神经元的变化与学习记忆力关系的探讨

　　海马存在于颞叶内，属于大脑边缘系统的一部分海马区按照它内部细胞形态的差异可分为海马回和断状回2部分海马回包括(CA1区、CA2区、CA3区,CA4区4部分，里位的神经元是以锥体细胞为上;街状回内主要为颗粒细胞海马的主要功能是负责学习、记忆和空间定位，人类日常生活中的短期记忆都储存于此,肝性脑病。HE)是山于肝病或多原囚的门一体分流所引起的以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调综合征该病以神经精神症状为主，患者记忆学习能力卜降、空间定位障碍和意识障碍是其临床主要表现2一3肝性脑病患者所表现出来的关于学习、记忆、空间定位障碍等症状有可能与其脑内海马神经元受损有关本实验旨在通过对肝硬化大鼠肝性脑病形成中海马齿状回神经元的形态、数目和光密度的研究来验证海马的功能与学习、记忆、空间定位关系，现将结果报道如下.　　1实验资料　　1.1肝性脑病大鼠模型的制作Wistar雄性大鼠50只，实验开始前所有动物进行Morris水迷宫测试即MWM侧试.然后在其中随机抽出10只动物作为正常组，其余40只作为实验组正常组正常饲养;实验组动物进行CCl联合5%乙醇自饮的方式在9周后获得肝硬化动物模型.然后用Morris水迷宫测试大鼠的学习、记忆和s间定位能力，根据MwM测试结果选出阳性动物再进行脑电图测试，再结合血液生物化学指标及日常行为学观察，可以确立动物肝性脑病模的建立1.2取材与组织处理2组大鼠用水合氯醛麻醉后打开胸腔，于心尖处剪开左心室，然后将管插人主动脉，再剪开右心房、先注人生理盐水进行冲洗，然后灌注含4%多聚甲醛液进行内固定，灌注完成后取脑干、脑桥基底部以上全脑和肝组织并在固定液中固定24h。之后置于含300蔗糖的磷酸缓冲液中(pH7.3)4℃过夜进行脱水，致其沉人瓶底。其中脑组织做40pm冰冻连续冠状位切片，收集在孵育液中，然后进行尼氏染色;肝组织石蜡包埋后行HE染色。肝组织HE染色:先从大鼠体内取肝组织块在甲醛中固定保持细胞本来的形态结构，然后再通过脱水透明、包埋、切片贴片和脱蜡染色等步骤完成染色。脑组织尼氏染色:取脑组织标本，先用乙醇进行脱水，后经石蜡包埋，切片机切片，切片厚约6Erm。二甲苯脱蜡，行常规梯度乙醇脱水后，把切片放在硫荃工作液中染色后置蒸馏水中迅速漂洗，经95%乙醇分色，二甲苯透明后最后用中性树胶封片。本实验所用的染料为硫荃，可以通过尼氏染色观察2组大鼠海马齿状回内神经元的数量及尼氏体、树突形态的变化来确定神经元是否受到损伤及损伤的程度。　　1.3图像分析采用德国莱卡公司DMRxAQ型显微镜扫描海马神经元切片，图像在监视器屏幕上放大400倍后，用图像分析软件莱卡Q}'IN进行分析，测定海马齿状回神经元的平均光密度值及数目。　　3.4统计学处理使用SPSS19.0统计软件包进行独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义2结果2.1造模前后Morris水迷宫测试逃避潜伏期比较见表1.　　2.2尼氏染色结果显微镜下海马齿状回神经元被染为蓝色。在正常组大鼠海马齿状回尼氏染色切片上，神经元数目多、色深，可见尼氏体被染成深蓝色，细胞核被染成淡蓝色，见图1;而相对应范围内实验组神经元数目明显变少，染色较对照组浅，胞浆内尼氏体减少或溶解，树突肿胀、断裂，见图2;以上表明海马神经元已严重受损。　　2.3图像分析结果经软件分析，正常组大鼠海马齿状回神经元光密度为0.81士0.07，数日为20.2士5.5:实验组大鼠海马齿状回神经元光密度为0.65土0.03，数目为11.9士2.8.表明实验组大鼠的海马齿状回神经元光密度值和数目较对照组均显著减小(P均<0.01).3讨论3.1 Morris水迷宫测试20世纪80年代英国心理学家莫里斯没计完成了Morris水迷宫实验，用于脑学习、记忆机制的研究，现在本实验已成为检验动物学习、记忆、空间的重要检测手段。目前制作空间辨别性学习记忆的动物模型方法比较多，迷宫法是其中的一种，该方法又可分为高架T迷宫、巴恩斯迷宫和高架卡字迷宫等，它们原理差不多都是以电击作为刺激因素.这对动物是一种伤害，使其产生应激反应，进而影响到学习记忆活动。而水迷宫测试法是以老鼠厌恶处于水中急于逃离水的本能性反应作为刺激因素。游泳十分消耗老鼠的体力，它们会本能地寻找藏匿在水中的休息场地，这种寻找行为与记忆过程密切相关，包括收集那些与空间定位有关的视觉信息，然后再对这些信息进行整理、记忆、再提取，其目的是能成功找到隐藏在水下的站台，最后离开水环境。这种方法对动物的伤害小，而且该模型是一种相关空间记忆的模型与海马功能密切相关。中枢神经受损如海马、豆状核大脑和小脑皮质均可导致水迷宫测试成绩下降，水迷宫测试现在已成为评估认知功能缺陷和神经认知能力状态的重要方法「5-6]。本研究采用Cl、联合乙醇自饮复合因素造成的大鼠肝性脑病模型，利用vlorri，水迷宫试验来测试大鼠的学习、记忆和空间认知能力。结果造模9周后实验组大鼠逃避潜伏期明显延长，说明CCl、联合乙醇复合因素造成的肝性脑病大鼠在第9周学习、记忆、空间定位能力出现明显障碍。　　3.2海马功能一与空阳〕记忆力、学习的关系本研究结果显示实验大鼠的学习、记忆和空间定位力下降应该是由于海马受损造成的。海马管理近期记忆，并将其记忆暂时储存于海马内，以便快速存取。国外科学家发现海一马在寻找新路线、捷径方面发挥了非常重要的作用。大脑影像研究显示，方向感比较强的人在辨别方位时，他们的海马变得异常活跃。记忆其实就是神经元之间不同形态的连接。然而，信息的储存或删除，不受大脑皮质的控制，而是由海马来决定。当大脑皮质中的神经细胞接收到各种各样的信息时，马上会把这些信息传递给海马L7!。如果海马接受了这些信息，海马内神经元之间就会形成持久的连接，相反如果这些信息没有被海马接受，脑部接收到的信息则会消失。存人海马的信息如果长时间没有被提取，就会慢慢被消除。科一研人员发现虽然某些形式的记忆能终身保持，但在一系列的记忆强化后海马便中止对记忆的保持海马受损后通常会发生顺行性失忆症也就是难以形成新的记忆，而且很难回忆起过去的事情即形成了逆行性失忆症。尽管这种遗忘在脑损伤之前就已经开始发生，但还是有一些久远的i己忆能够存留下来B-4，这表明海马将巩固以后的记忆存人了脑的其他位置。　　3.3学习、记忆能力原理学习和记忆可以看做是大脑从外部获取和保持信息的过程，西班牙科学家圣地亚哥·拉姆恩·卡扎尔最先提出了信息是以改变突触传递效率的力一式贮存于大脑的，同时他还提出大脑能通过增加突触数目或改变突触形式来完成学习记忆。突触的可塑性改变是学习和记忆的神经生理学基础，利一学家们热衷十研究它与大脑学习记忆过程机制的关系I,P1'即中枢兴奋性突触的长时程增强是神经元可塑性的主要表现形式之一。其分子生物学基础是在海马神经元突触上有能和谷氨酸结合的NMD1受体即N一甲基-D-天冬氨酸受体，这种特异的受体存在于突触后成分上，属十离子通道蛋白，能特异的和天冬氨酸受体结合它同时接受谷氨酸和电压的调控，只有当动作电位到来而谷氨酸又同时从突触前成分释放并与受体结合之后，天冬氨酸受体才发挥作用，它会打开离子通道，让Na十和Ga}十从细胞外进人到细胞内从而产生突触后电位;而Cat十的内流又可触发很多的生物化学反应，促进某些特殊基因的表达及蛋白质的合成，通过这些生物化学反应，可促使合成更多的受体蛋白，使突触神经递质的数量增加，增强了突触的联系强度L'1'P和天冬氨酸受体是海马记忆学习功能的关键因素。由于天冬氨酸受体和非天冬氨酸受体相邻，非天冬氨酸受体可以为天冬氮酸受体激活的膜去极化提供条件，非天冬氨酸受体协同天冬氨酸受体参与了兴奋传导和突触可塑性改变。综上所述，肝性脑病时学习、记忆力下降的原因可总结为:因海马内谷氨酸减少，引起谷氨酸受体相应下调，弱化了LTP，使突触的可塑性下降，进而导致学习、记忆力下降。　　[参考文献]     罗焕敏. 海马结构--从形态、功能到可塑性、衰老性变化[J].神经解剖学杂志,1996,(02):177-184.    朱顺强. 肝性脑病的诱发因素探讨[J].中国实用神经疾病杂志,2011,(22):60-61.doi:10.3969/j.issn.1673-5110.2011.22.038.    王立鹏,陈晓,高峻. 肝性脑病中氧化应激参与氨中毒的研究进展[J].国际消化病杂志,2011,(02):95-96.    刘冀,朱建忠,隋月林. 四氯化碳诱导大鼠肝性脑病模型的制备[J].中国比较医学杂志,2012,(02):33-37.doi:10.3969/j.issn.1671.7856.2012.02.008.    Bergen WG,Wu G. Intestinal nitrogen recycling and utilization in health anddisease[J].Journal of Nutrition,2009.821-825.    Haussinger D,Gorg B. Interaction of oxidative stress.as-trocyte swelling and cerebral ammonia toxicity[J].Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care,2010,(01):87-92.    Chastre A,Jiang W,Desjardins P. Ammonia and proinflammatory cytokines modify expression of genes codingforastroeytic proteins implicated in brain edema in acute liver failure[J].Metabolic Brain Disease,2010.17-21.    Norenberg MD,Rama Rao KV,Jayakumar AR. Ammonia neurotoxicity and the mitochondrial permeability transition[J].Journal of Bioenergetics and Biomembranes,2004.303-307.    McClung JP,Beer ER,LaMorte WW. Role of stasis and oxidative stress in ileal pouch inflammation[J].Surgical Research,2000.67-75.