HPLC法测定甘草素的平衡溶解度和表观油水分配系数

　　甘草素(liquiritigenin)是一种从甘草中提取的二氢黄酮单体成分，是Akt蛋白激酶抑制剂，也是一种高选择性的雌激素受体激动剂，具有细胞保护、抑制急性肝损伤、抗肿瘤等多种生物活性，结构式如图1。根据本实验室前期研究，甘草素的体内外抗肿瘤作用突出，对人结肠癌LOV。细胞和人肝癌SMMC一7721细胞的生长均有抑制作用，对SMMC一7721细胞的生长抑制作用更加明显，并能诱导SMMC一7721细胞凋亡。进一步研究结果表明，甘草素能延长Hzz荷瘤小鼠的生存时间，抑制瘤体增生及诱导肿瘤组织细胞凋亡。此外，甘草素的合成方法多样，，工艺已较为成熟。因此，甘草素是一种从天然植物中分离出来并可以合成的抗肿瘤活性成分，有希望开发成为新一代抗肿瘤有效药物。　　作为在研一类化药新药，测定其溶解度和油水分配系数对于预测其药物代谢动力学性质和剂型研究具有重要意义，进而有助于指导临床用药。鉴于甘草素的平衡溶解度和表观油水分配系数未见文献报道，本文根据人体胃肠道不同部位pH环境的不同，采用高效液相色谱(HPLC)法测定了甘草素在不同pH条件下的平衡溶解度和表观油水分配系数，以期为甘草素的剂型研究及吸收代谢等相关研究提供参考。　　1仪器与试药　　ShimadzuLC-20ABHPI,C系统(日本岛津公司)，包括在线脱气机，ProminenceSIL一20A自动进样器，SPD一M20A二极管阵列检测器和CTO-20A柱温箱;BP211D型电子天平(德国Sartorius公司);KQ3200DB型数控超声仪(昆）市超声仪器有限公司);pH一3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);THZ一82水浴恒温振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司);TGL一16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);YU-ZU0201106一17型去离子水设备(上海统洁环保科技有限公司)。　　甘草素(本实验室合成，纯度大于98%，与文献报道一致);乙睛为色谱纯(美国天地试剂公司);水为去离子水(实验室自制);其余试剂均为分析纯，甲醇、乙醇、冰醋酸(南京化学试剂有限公司)，盐酸(上海中试化工总公司)，二氯甲烷、石油醚(无锡市亚盛化工有限公司)，NaC仁NaOH,NaAc,KHZP04,KzHP04(国药集团化学试剂有限公司)。　　2方法　　2.1色谱条件色谱柱:TigerkinC8T(5A,m,4.6mmx250mm);流动相:乙睛一水(40:60,vlv);流速:1mL·min;柱温:35℃;检测波长:274nmo在上述色谱条件下，甘草素的保留时间为6.239min，如图2．2.2标准曲线的制备精密称取甘草素对照品5.19mg置25mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得到0.2076mg·mL储备液。精密量取储备液0.25,0.5,1.0,1.5,2.0mL于10mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，得到5.19,10.38,20.76,31.14,41.52},g·mL-‘的对照品溶液，为高质量浓度范围的标准液;另取原5.19,g·mL的对照品溶液，精密量取0.1,0.25,0.5,1,2,4,8mL于10mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，得到0.051叭0.12975、0.2595、0.519、1.038、2.076、4.152l.g"mL的对照品溶液，为低质量浓度范围的标准液。按从低到高浓度分别进样20},L，记录峰面积。　　2.3精密度试验分别在高、低质量浓度范围的标准液中取高、中、低浓度(41.52,20.76,5.19},g·mL和4.152,0.519,0.0519},g·mL)的甘草素甲醇溶液，按“2.1”项下色谱条件1d内连续进样6次，记录峰面积，计算RSD，考察日内精密度;连续进样Sd，每天1次，记录峰面积，计算RSD，考察日间精密度。　　2.4准确度试验分别在高、低质量浓度范围的标准液中取高、中、低浓度(41.52,20.76,5.19p,g·mL和4.152,0.519,0.0519p,g·mL)的甘草素甲醇溶液，按标准曲线得到对应的浓度，求出高、中、低浓度的准确度。公式如下:准确度=测定浓度值/真实浓度值x100%　　2.5稳定性试验按“2.1”项下的色谱条件，分别对不同溶剂(水、0.9%氯化钠溶液、乙醇、二氯甲烷、石油醚)、不同pH(pH1.0的盐酸溶液及pH2.5,pH3.6、pH4.5、pH5.8、pH6.8、pH7.4、pH8.0的缓冲液)条件下的甘草素溶液在振摇前和振摇48h后进样测定。　　2.6平衡溶解度的测定在10mL玻璃离心管中分别加人2mL以下5种溶剂:水、0.9%氯化钠溶液、乙醇、二氯甲烷、石油醚，取过量甘草素加人其中，直到管壁上挂有不溶解的甘草素为止。另取10mL玻璃离心管，分别加人2mL以下溶液及缓冲液组:pH1.0的盐酸溶液、pH2.5,pH5.8,pH6.8,pH7.4,pH8.0的磷酸盐缓冲液以及pH3.6,pH4.5的醋酸盐缓冲液，取过量甘草素加人其中，直到管壁上挂有不溶解的甘草素为止。分别用封口膜封好后放人恒温水浴振荡器中，温度保持在(37士1)℃，振摇48h，使其达到充分溶解后，混悬液在3000:·min条件下离心15min，上清液过0.45N.,m微孔滤膜，取续滤液按“2.1”项下色谱条件进样20},L，超出线}h}范围的样品用甲醇稀释一定的倍数后进样，记录峰面积，计算甘草素在各介质中的平衡溶解度。　　2.7表观油水分配系数的测定将正辛醇分别加人pH1.0的盐酸溶液及pi42.5,pH3.氏pH4.丘pH5.8,pH6.8,pH7.4,pH8.0的缓冲液中，超声振荡后静置24h，配制成正辛醇饱和缓冲液。取适量甘草素分别加人正辛醇饱和缓冲液中，超声振荡Smin至溶解后，溶液过0.45p.,m微孔滤膜，取续滤液按“2.1”项下色谱条件进样20p,L，记录峰面积玖，按标准曲线计算得到浓度C,。精密量取该溶液2mL，置于10mL玻璃离心管中，再精密加人2mL各缓冲液饱和的正辛醇，分别用封口膜封好后放人恒温水浴振荡器中，温度保持在(37土1)℃，振摇48h，使其在两相中充分平衡。静置后取下层水液在3000r·min条件下离心15min，溶液过0.45Nm微孔滤膜，取续滤液按“2.1”项下色谱条件进样20p,L，记录峰面积姚，按标准曲线计算得到浓度CZ。按照公式计算表观油水分配系数(Ｐ)，计算公式如下:　　P=(C;一CZ)/CZ　　3结果　　3.1线性关系考察以甘草素浓度(Ng'mL-i)为横坐标，峰面积为纵坐标，得高、低质量浓度范围线性回归方程分别为:Y=6.723x10+1.080x10'r＝0.9998Y＝6.601x104X+931.5r=0.9998结果表明，甘草素浓度在5.19一41.52p,g·mL和0.0519}4.152}i,gmL-'范围内与峰面积呈良好的线性关系。　　3.2精密度试验高质量浓度范围中，甘草素高、中、低浓度的日内精密度RSD分别为0.6%}0.2%,0.2%，日间精密度RSD分别为0.6%,0.9%,0.8%;低质量浓度范围中，甘草素高、中、低浓度的日内精密度RSD分别为0.7%,0.6%,1.2%，日间精密度RSD分别为0.8%,1.0%,1.3%。日内精密度和日间精密度的RSD均小于2.0%，说明此方法的精密度良好。　　3.3准确度试验高质量浓度范围中，高、中、低浓度甘草素甲醇溶液的准确度分别为99.9%,97.9%,102.6%;低质量浓度范围中，高、中、低浓度甘草素甲醇溶液的准确度分别为98.1%,100.9%}99.7%，表明该方法的准确度良好。　3.4稳定性试验不同溶剂(水、0.9%氯化钠溶液、乙醇、二氯甲烷、石油醚)、不同pH(pH1.0的盐酸溶液及pH2.5,pH3.6,pH4.5,pH5.8,pH6.8,pH7.4,pH$.0的缓冲液)条件下的甘草素溶液在振摇前和振摇48h后，含量基本未发生变化，表明48h内，甘草素在不同溶剂、不同pH条件下稳定。　　3.5平衡溶解度试验结果甘草素在37℃下不同溶剂中的平衡溶解度见表1，在不同pH缓冲盐溶液中的平衡溶解度见图3。结果显示甘草素在乙醇中溶解度最大，在碱性溶液中的溶解度较酸性溶液中大。　　3.6表观油水分配系数试验结果37℃下甘草素的表观正辛醇/水分配系数为21.94(1gP＝1.34)，在pH1.2的盐酸溶液中表观油水分配系数最小为15.10(1gP=1.18)，在pH5.8的磷酸盐缓冲液中表观油水分配系数最大为37.23(1gP=1.57)，其余缓冲液的表观油水分配系数处于两者之间，结果如图4．4讨论本研究建立了甘草素的HPLC含量测定方法，在此条件下的线性、精密度、准确度及溶液稳定性均符合要求，表明该测定方法准确可行。　　采用经典摇瓶法测定了甘草素的平衡溶解度和表观油水分配系数。由于体内温度约为370C,胃肠道的生理pH范围在1.4一8.Qao，因此选择测定温度为370C，选用此pH区间的缓冲液作为溶剂。正辛醇溶液的溶解度参数与生物膜的溶解度参数一致，均为21.07MPa1'2，故选用正辛醇模拟生物膜，对药物的透过性有一定的参考依据。　　药物的溶解度常常会直接影响到药物的生物活性，可以作为筛选新药的标准。甘草素的溶解度测定结果表明，甘草素在乙醇中溶解度最大，在强极性溶剂(水)中溶解度很小，在弱极性溶剂(石油醚)中不溶，表明甘草素为中等极性的化合物。由甘草素的结构看，甘草素分子中含有2个酚轻基，属于二氢黄酮类化合物，为弱酸性药物，随着溶液pH的增大，其在水溶液中的溶解度也随之增大，所以甘草素的溶解度随pH的增大呈现整体增加的趋势。由此在药物的制剂设计中，可以考虑通过适当调节pH或与某些碱性化合物成盐或形成分子复合物的方法改变其生物药剂学性质，以利于在体内更好地发挥疗效。　　体外测定油水分配系数是为了模拟生物体内药　　物在水相和生物相之间的分配情况，从而预测其在肠道中的吸收情况1gP对于药物在胃肠道的吸收速度和程度有很大影响，具有适当脂溶性和水溶性的药物，较易通过生物脂质双分子膜吸收进人体内发挥疗效。有研究表明，药物吸收的最佳范围是一1<1gP<2。本实验中表观油水分配系数测定结果显示，甘草素在pH1.0一8.0的缓冲液中，1gP大致为1.18一1.57，波动幅度不大，处于药物最佳吸收范围，提示其渗透性好，在整个胃肠道中应均能被吸收。　　由上述平衡溶解度和表观油水分配系数的测定结果可预测:甘草素水溶性较差，但渗透性好，应属于生物药剂学分类系统的11类药物。因此，提高药物溶解度是今后研究的重点，可考虑应用增溶辅料或通过环糊精包合、微乳、脂质体、纳米等制剂技术来改善药物溶解度，以改善体内吸收，提高生物利用度。　　参考文献1 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