乙型肝炎病毒逆转录酶区PCR产物测序方法的建立及应用

  近年来由于拉米夫定（LMV）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）和替比夫定（LdT）等核苷（酸）类似物（NA）抗病毒药物在临床乙型肝炎治疗方面的广泛使用，导致了乙型肝炎病毒（HBV）耐药问题的出现[1].目前公认的核苷（酸）类似物变异位点发生在HBV聚合酶（P）区的逆转录酶（RT）区。拉米夫定的耐药株主要是YMDD基序的变异，RT区YMDD基序204位点的甲硫氨酸（methionine）被结氨酸（valine）或异亮氨酸（isoleucine）所替代（RTM204V/I）；阿德福韦耐药株主要发生在RTN236T和RTA181V/T;恩替卡韦具有较高的耐药基因屏障，需要3个（或3个以上）位点同时突变才能产生耐药性，包括2个拉米夫定耐药位点（L180M+M204V/I），另外的突变位点还包括T184G、S202I和M250V中一个位点变异[2-4].RT区全长1032bp,正好重叠S基因的编码区，通过对S基因的序列比对，可以确定HBV的基因型，因此通过对扩增的RT区分析可同时获得HBV的基因型信息。目前分析RT区耐药变异位点的方法有多种，但测序法无疑是“金标准”[5-6],通过对测序序列的分析，除了能检测出已知耐药突变位点，同时能发现新的耐药相关突变位点。因此，本研究拟建立扩增RT区，测序并分析病毒基因型及是否出现耐药位点突变的方法，并初步验证其在临床样本分析中的实用性。  1材料与方法  1.1材料HBVB、C基因型，拉米夫定耐药株，恩替卡韦耐药株全长重组质粒由本实验室构建保存。慢性乙型肝炎患者血清样本收集于2012年12月到2013年3月在本院门诊及住院治疗的患者，临床诊断标准参照2000年9月（西安）全国会议修订的《病毒性肝炎防治方案》标准[7].抽取患者血液，分离血清于-80℃冰箱保存备用。  1.2方法血清病毒核酸提取试剂盒购自硕世生物技术有限公司，DNA聚合酶为TaKaRa公司的ExTaq酶，PCR扩增仪为ABI-7500PCR仪，凝胶成像系统为SYN-GBOX.  1.3检测方法  1.3.1检测方法的建立采用了巢式PCR法，参考文献[8]方法设计引物，HBVRTF1:5′-TTATTTACATACTCTKTGGAAGGC-3′，HBVRTR1:5′-CTAGGAGTTCCGCAGTATGGAT-3′，HBVRTF2:5′-GTGGCTCCAGTTCMGGAACAGT-3′，HBVRTR2:5′-CTAGGAGTTCCGCAGTATGGAT-3′，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成部合成。扩增条件：第1轮反应，94℃2min;94℃30s,50℃30s,72℃2min,35个循环；72℃10min.第2轮反应，94℃2min;94℃30s,55℃30s,72℃1.5min,35个循环；72℃10min.扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离、切胶回收后送上海英骏生物公司测序部测序。  1.3.2验证方法保真度以已经完成测序的HBVB、C基因型，拉米夫定耐药株，恩替卡韦耐药株全长重组质粒0.2μL为模板，参照1.3.3建立的方法扩增质粒的RT区。测序后DNASTAR软件将序列与质粒已测序列比对，验证方法保真度。  1.3.3确定方法灵敏度以已知浓度HBV血清进行系列稀释，获得溶液终浓度为1×108、1×107、1×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103copys/mL的血清。严格按照血清病毒分离试剂盒说明书提取病毒DNA,扩增条件及方法参照1.3.2步骤。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离以验证方法灵敏度。  1.3.4验证方法实用性慢性乙型肝炎患者血清HBVRT区扩增及测序。血清病毒分离试剂盒提取慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA,扩增条件及方法参照1.3.2步骤。测序后DNASTAR软件分析耐药突变位点，NCBI（http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）在线分析基因型。  2结果  2.1方法保真度的验证HBVB、C基因型，拉米夫定耐药株，恩替卡韦耐药株全长重组质粒均扩增出1223bp的条带见图1（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）；PCR物测序序列与质粒已测序列比对证实：4个PCR产物测序序列与质粒已测序列完全一致，见图2~5（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。  2.2方法灵敏度验证已知浓度为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copys/mLHBV血清扩增HBVRT区后在1223bp位置出现明显条带，均能够达到PCR产物切胶回收送测序的浓度见图6（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。  2.3方法实用性验证对4例慢性乙型肝炎患者血清HBVRT区扩增及测序后，电泳时均能在1223bp位置出现明显条带见图7（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”），测序后DNASTAR软件分析检出2例出现耐药位点突变见图8（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”），NCBI在线分析发现3例为C基因型，1例为B基因型见图9~10（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。  3讨论  由于自身的免疫压力及药物的筛选作用，通常引起的HBV耐药突变是一种HBV基因的致畸或致死突变，使血清中病毒载量维持在低水平浓度[9],本方法采用的巢式PCR,可以大大提高检测的灵敏度，所采用的ExTaq酶也兼具保真性和扩增效率。作者能从病毒载量1×103~1×108copy/mLHBV血清中均能扩增到目标序列。HBV基因型分布有较明显的地域特征，A、D型主要分布在欧洲和美国，B、C型主要分布在东南亚和东亚，E型在西非流行，F型集中在中南美洲，而G型仅在个别国家有单个案例报道[10].我国以B、C基因型为主，因此，本方法验证了HBVB、C基因型质粒的特异性[11].  本研究采用的PCR产物直接测序法也有缺陷。病原体的核酸突变可造成体内同时存在基因序列有微小差别的种群，HBV基因序列的异质性和准种特点是慢性HBV感染患者普遍存在的一种现象[12],因此，在PCR扩增过程中的模板其实是一个有微小差别的基因序列组成的模板库，只是看哪个模板在数量上更占优势。目前常用的几种耐药位点检测方法要求耐药株达到的比例分别为：PCR产物直接测序法大于20%,INNOLiPA线性杂交法大于5%,实时荧光PCR法在1%~5%之间，超深焦磷酸测序法大于1%.因此，作为补救措施，当测序峰图出现明显重叠峰时，可以将HBVRT区PCR扩增产物克隆后挑斑测序，每个样本需测定10~20个克隆，以获得正确的序列信息。  本方法通过扩增HBVRT区，可以同时给临床提供HBV耐药变异及HBV基因型信息，可收到一举两得的效果。  参考文献  [1]TangkijvanichP,Sa-NguanmooP,AvihingsanonA,etal.Charac-terizationofhepatitisBvirusmutationsinuntreatedpatientsco-infectedwithHIVandHBVbasedoncompletegenomesequen-cing[J].MedVirol,2013,85（1）：16-25.  [2]Alvarado-MoraMV,RomanoCM,Gomes-GouveaMS,etal.Phy-logeneticanalysisofcompletegenomesequencesofhepatitisBvi-rusfromanAfro-Colombiancommunity:presenceofHBVF3/A1recombinantstrain[J].Virol,20129（3）：244-248.  [3]李志军，苏智军，林成祖，等。23株HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者病毒的全基因组分析[J].中国人兽共患病学报，2011,27（8）：728-730.  [4]OdgerelZ,ChoiIK,ByunKS,etal.CompletegenomesequenceandphylogeneticanalysisofhepatitisBvirus（HBV）isolatedfromMongolianpatientswithchronicHBVinfection[J]VirusGenes,2006,33（3）：345-349  [5]吴若芬，师志云，贾伟，等。3种HBVDNA荧光定量PCR试剂检测结果比较[J].中国现代医学杂志，2011,21（2）：206-207  [6]吴光华，丁惠国，曾长青。公共核酸数据库乙肝病毒全基因组序列概况和中国HBV参照序列的建立[J].自然科学进展，2008,18（2），121-129.  [7]中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会。病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志，2000,8（6）：324-329.  [8]刘宝明，李彤，董建平，等。A~D基因型乙型肝炎病毒全长逆转录酶区PCR方法的建立及应用[J].肝脏，2008,13（5），379-383.  [9]成军，董菁，洪源，等。乙型肝炎病毒中国流行株全基因的克隆与序列分析[J].世界华人消化杂志，2003,11（8）：1083-1090.  [10]黄月华，周彬，王站会，等。中国乙肝病毒B基因亚型的分布[J].中华实验和临床病毒学杂志，2007,21（2）：111-113.  [11]KesslerH,StelzlE,MarthE,etal.DetectionofmutationsinthehepatitisBviruspolymerasegene[J].ClinChem,2003,49（5）：989-992.  [12]CiancioA,SmedileA,RizzettoM,etal.IdentificationofHBVDNAsequencesthatarepredictiveofresponsetolamivudinetherapy[J].Hepatology,2004,39（1）：64-73.  （收稿日期：2013-11-28）