活性氧在PTCA术后血管平滑肌细胞增殖中的作用

　　作者：孙跃玲 综述, 涂远超, 黄从新 审校 作者单位：郧阳医学院附属太和医院心血管内科,湖北 十堰 442000

　　【关键词】 活性氧

　　再狭窄是影响经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous trans luminal coronary angioplasty，PTCA)远期疗效的主要障碍。它的病理生理过程特点是内膜增厚和动脉壁重塑，造成球囊扩张部位的血管管腔狭窄。在内膜剥脱之后立即有中层血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)死亡发生，随后存活VSMCs明显增殖。这些细胞伴随外膜细胞(成纤维细胞)通过内弹力层迁移形成新生内膜层。这些造成再狭窄的细胞事件机制还不完全清楚。近年研究发现活性氧参与再狭窄的发生、发展。本文就PTCA术后活性氧的产生及其对血管平滑肌细胞的影响作一综述。

　　1 活性氧的产生及代谢活性氧是指由氧形成并含有氧的一类性质活泼的物质的总称，包括超氧化物阴离子自由基(O2-)、过氧化氢(H2O2)、氢氧自由基(OH·)、单线态氧(1O2)以及脂质过氧化物等。生物体内产生活性氧的来源很多，几乎所有类型血管细胞都能产生O2-和H2O2 [1]。在生理状态下，线粒体是活性氧的主要来源。正常时98%的O2经线粒体的氧化还原酶系统还原成水，仅2%在呼吸链电子传递中形成自由基。线粒体内存在有效抗氧化机制，O2-可以由超氧化物歧化酶(SOD)催化生成H2O2，后者可被谷胱甘肽过氧化物酶转化成水。除线粒体外，O2-和/或H2O2可来自黄嘌呤氧化酶、环氧合酶、脂氧酶、NO合酶、血红素氧化酶、NADH/NADPH氧化酶[2]。氧自由基作为细胞需氧代谢的正常产物，除具有消灭病原微生物的基本作用外，还具有其它一些重要的生物活性，如许多蛋白质的功能在很大程度上依赖它们的氧化还原状态，包括生长因子受体、蛋白激酶、蛋白磷酸酶、G蛋白受体及许多重要的转录因子。活性氧充当对外界刺激反应的细胞内第二信使，活化信号，转导级联反应，刺激细胞增殖和凋亡[3，4]。

　　2 氧化应激生理状态下，机体内自由基的生成和清除处于平衡状态，不会发生有害作用。但当活性氧产生过多，机体抗氧化机制不能及时清除时，如介入损伤、心肌缺血/再灌注损伤、缺血预处理、高糖血症、急慢性炎症时，活性氧参与一系列氧化过程来氧化生物大分子如DNA、蛋白质、碳水化合物和脂质。这种状态通常称为氧化应激。氧化应激产生大量氧自由基,并在体内发生连锁反应，生成多种高活性的氧化还原中间代谢产物，引起脂质过氧化、蛋白质变性交联、DNA断裂，同时刺激细胞信号转导，参与细胞的增殖与凋亡等病理生理过程。

　　3 PTCA术后活性氧增多大量文献报告PTCA术后活性氧增多。Pollman[5]在兔的颈动脉球囊损伤后30 min测血管谷胱甘肽水平快速下降达63%，提示球囊损伤早期活性氧的产生。Nunes[6]对猪冠状动脉PTCA术15 d后O2-生成情况进行研究，表明损伤血管段与未损伤血管段、同一血管的损伤段与未损伤段相比，O2-的产生是后者的2～3倍。Nunes对其细胞来源进行深入研究，认为PTCA术后O2-可能主要来自血管中膜和新生内膜的平滑肌细胞和成纤维细胞。文献[7]报告，在球囊损伤后15 d整个血管壁仍有O2-的产生。为了明确O2-产生的细胞类型，损伤血管段的组织切片用大鼠抗鼠ED1抗体孵育，此用来染色巨噬细胞和粒细胞，在包埋前将外膜移走，在第3、15 d未发现阳性信号,相反对平滑肌α-肌动蛋白染色结果呈阳性。因此认为O2-的增加不是由于炎性细胞渗出，而是来源于中膜和新生内膜的平滑肌细胞以及外膜细胞。

　　4 活性氧增多机制目前认为血管损伤后参与O2-生成途径主要包括：①线粒体的氧化呼吸作用;②膜结合的NADH/NADPH氧化酶;③花生四烯酸代谢酶;④黄嘌呤氧化酶;⑤某些组织代谢产物的自氧化作用。同黄嘌呤氧化酶、花生四烯酸代谢酶、线粒体氧化酶相比，非吞噬细胞膜结合的NADH/NADPH氧化酶是血管组织产生O2-的主要氧化酶[8，9]。心血管NADH/NADPH氧化酶与中性粒细胞NADPH氧化酶比较有二点不同:①心血管NADH/NADPH氧化酶产生O2-是低产出的，它的量是中性粒细胞NADPH氧化酶生成O2-量的1/3;②慢释放：O2-生成可持续数小时，而吞噬细胞NADPH氧化酶产生O2-是瞬时释放。心血管NADH/NADPH氧化酶在基础情况下产生相当低水平活性氧，在生长因子和细胞因子作用下产生高水平活性氧。PTCA术机械损伤导致血管局部发生复杂病理生理变化，使巨噬细胞和平滑肌细胞释放多种细胞因子、生长因子及血管肽类物质。如血管紧张素Ⅱ作用于VSMCs和成纤维细胞，刺激NADH/NADPH氧化酶活性增加[10，11]。Seshiah等[12]发现血管紧张素Ⅱ激活NADH/NADPH氧化酶是通过两步：先依赖蛋白激酶C(PKC)活化，随后小分子G蛋白Rac活化再激活NADH/NADPH氧化酶。而加用PKC或Rac抑制剂则NADH/NADPH氧化酶活性下降，活性氧产生明显减少。另外血管紧张素Ⅱ等活性物质能增加NADH/NADPH氧化酶的产生。文献[7]报告，PTCA术后3 d VSMC NADH/NADPH氧化酶sp22phox和gp91phox同源异构体nox1mRNAs表达分别增加2.7倍和3.6倍，并持续升高至15 d。另有研究发现[13]血管紧张素Ⅱ和血小板源性生长因子(PDGF)能明显上调VSMCs nox1 mRNAs表达。这些物质通过NADH/NADPH氧化酶使活性氧产生增加。文献[14]报告，活性氧产生后,其中的H2O2又经NADH/NADPH氧化酶诱导,O2-产生增加。

　　5 平滑肌细胞的增殖与凋亡VSMCs的增殖和凋亡在动脉粥样硬化、再狭窄中起着重要的作用。活性氧(主要是H2O2、O2-以及OH·)已被证明可以增加VSMCs增殖。活性氧可以通过直接和间接方式刺激血管平滑肌细胞增殖。Li等[15]报道，将VSMCs暴露于黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤环境中1 h产生O2-，导致[3H]-胸腺嘧啶掺入率和细胞记数增加。RAO[16]报道，H2O2可直接增加VSMCs的DNA合成，促进c-myc和c-fos mRNA表达增加。而原癌基因的表达增加是细胞增殖、分化的最早标志，提示活性氧的促增殖作用。进一步研究认为活性氧直接刺激血管平滑肌细胞增殖是通过激活信号转导事件，激活许多细胞内激酶如PKC、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和许多酪氨酸激酶，增加生长因子的表达及分泌。如H2O2可刺激碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)等的分泌[17]。Bass等[18]报道，LY83583刺激血管平滑肌细胞产生O2-的量明显增加，[3H]-胸腺嘧啶掺入率和细胞记数较对照组分别增加175%和300%，并且认为O2-诱导VSMCs增殖的关键环节是活化了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)。Tiron是O2-清除剂，当VSMCs培养基中同时加入Tiron和LY83583时，Tiron能显著抑制LY83583对MAPK的活化作用。O2-活化MAPK是PKC依赖性的，PKC活化后通过直接激活Ras/MAPK通路诱导VSMC原癌基因表达。将PKC活性下调，则LY83583刺激VSMC不能激活MAPK。文献[19]证明H2O2刺激ERK1、ERK2、p38MAPK活性，增加早期即时基因c-Jun和fra-1表达。过氧化氢酶可阻断H2O2对MAPK的作用。Yamakawa[20]发现溶血磷脂酰胆碱促进VSMCs有丝分裂反应是通过激活ERK1/2途径。除了直接刺激VSMCs增殖，各种生长因子、细胞因子如血管紧张素Ⅱ、胰岛素、白细胞介素-1、PDGF等可利用活性氧作为第二信使，活化信号，转导级联反应，间接促进VSMCs增殖。活性氧作为生长因子的第二信使的证据有：①生长因子和细胞因子能在许多细胞内促进活性氧的产生[10，13];②抗氧化剂和产生活性氧的酶系统阻滞剂可以阻断特定生长因子和细胞因子活化的信号转导事件或生物效果[13,21,22];③加入氧化剂可诱导出同样细胞因子和生长因子介导的信号转导通路或生物效果[19]。活性氧可以直接或作为第二信使间接促进平滑肌细胞增殖，其参与激活的信号转导途径很多，目前认为主要有MAPK途径及PKC途径。此外文献[23]报道H2O2还可经JAK以及STAT途径促进增殖。在MAPK途径中激活物蛋白-1(AP-1)的激活是重要的一步。活性氧首先激活Ras蛋白，使Ras-GDP转变成Ras-GTP，Ras先结合丝氨酸/苏氨酸激酶Raf，再由Raf顺序激活MAPK，后者引起重要的转录因子AP-1的组成成分Fos和Jun磷酸化，并发生转位，与相应DNA小盒结合，启动相关基因转录。转录因子NF-κB是活性氧丝裂效应的另一重要调控机制。NF-κB通常与其抑制蛋白IκB形成三聚体以失活状态存在于细胞质中。在PKC途径中，活性氧激活PKC，PKC使IκB磷酸化、泛素化，并被蛋白酶降解，NF-κB遂从三聚体中释放出来，迅速移位入细胞核，与靶基因上启动子区κB位点发生特异性结合，从而启动基因转录。Finco[24]报道，NF-κB-I-κB的解离需要Ras或Raf激活参与。而Bass认为MAPK的激活是PKC依赖性的[18]。Griendling等[2]报告损伤及各种细胞因子、生长因子作用于NADH/NADPH氧化酶，产生大量活性氧，经修饰蛋白酪氨酸激酶如c-Src和丝氨酸/苏氨酸激酶如MAPK、PKC、JNK、AKt等，再将下游的酶激活，最后激活转录因子，主要有AP-1和NF-κB。后者启动有关基因的转录。总之，目前活性氧参与多条信号转导通路的激活，经过不同或交叉的通路对VSMCs的增殖进行调节。但具体更详细的机制有待进一步研究。但是也有大量文献报道活性氧可诱发平滑肌细胞凋亡[15,25,26]。Li[15]研究显示，反复接触黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤或过氧化氢-铁(Ⅱ)将诱导平滑肌细胞发生凋亡。深入研究揭示，导致凋亡的活性氧分子不是O2-，而是过氧化氢-铁(Ⅱ)。Stiko等[25]报告在低浓度时H2O2刺激VSMCs DNA合成，呈剂量依赖方式，最大效果在200 μmol/L浓度，而更高浓度则抑制DNA合成。Malik等[27]的研究提示PTCA术后早期凋亡细胞出现，6 h达峰值，14 d恢复到低水平。主要细胞类型是平滑肌细胞、炎性细胞和外膜成纤维细胞。凋亡先于细胞的增殖，但细胞增殖的数量明显超过凋亡数。有研究表明[28]，在检测动脉粥样硬化原有斑块和再狭窄斑块中的细胞凋亡频率发现：同原有粥样斑块比较,再狭窄斑块中血管平滑肌细胞的密度更高,凋亡水平明显减少。这种对细胞凋亡抵抗的分子机制可能是：与中膜细胞比较，内膜平滑肌细胞表达高水平的抗凋亡基因bcl-XL，不易发生凋亡。Pollman[5]观察到在兔颈动脉球囊导管扩张诱发的血管损伤中30 min即可观察到大量中膜细胞凋亡，用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以明显抑制凋亡的发生。与中膜不同，新生内膜对凋亡性死亡有较大抵抗，它与内膜平滑肌细胞抗凋亡基因bcl-XL表达上调有关。上述研究提示在动脉粥样硬化和再狭窄形成过程中的不同阶段，活性氧由于细胞外不同条件的刺激对血管平滑肌细胞的增殖和凋亡发挥不同的调控作用。

　　6 结论介入性动脉损伤后通过NADH/NADPH氧化酶使活性氧生成增加。活性氧可以直接或作为第二信使，通过多个信号转导通路激活靶基因，从而促进VSMCs增殖，在一定环境下促进VSMCs凋亡。因此活性氧在再狭窄的发生发展中具有重要的作用。进一步阐明活性氧在平滑肌细胞的增殖中的分子作用机制不仅有助于揭示再狭窄发生的本质，而且可以为防治再狭窄提供新的治疗措施。

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