阿托伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌保护的内质网应激途径研究

　　作者：刘忠仁 作者单位： 右江民族医学院附属医院心血管内科

　　【摘要】 目的 通过观察阿托伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注损伤后GRP78和GADD153蛋白表达的影响，探讨阿托伐他汀心肌保护的内质网应激途径。方法 SD大鼠54只随机分为阿托伐他汀干预组24只[灌喂20mg/(kg·d)]、模型对照组24只(0.9%氯化钠溶液灌喂2ml/d)和假手术组6只(0.9%氯化钠溶液灌喂2ml/d)，制作大鼠心肌再灌注损伤模型。通过TUNEL检测心肌细胞凋亡，免疫组织化学检测GRP78和GADD153表达变化。结果 相邻各时间点比较，阿托伐他汀干预组大鼠心肌细胞凋亡明显比模型对照组减少(P<0.01)。在相应时间点，干预组的GRP78蛋白表达水平比模型对照组升高(P<0.05)，同时GADD153的蛋白表达水平明显比模型对照组下降(P<0.01或P<0.05)。结论 通过内质网应激途径可能是阿托伐他汀发挥在心肌再灌注后损伤的保护作用机制之一。

　　【关键词】 冠状动脉疾病;心肌梗死;阿托伐他汀;动物，实验

　　The endoplasmic reticulun stress signaling pathways for Atorvastatin

　　in protection of myocardium in ischemia/reperfusion injury model rats

　　LIU Zhong-ren

　　(Department of Cardiology, The Affiliated Hospital to Youjiang Medical University

　　for Nationalities, Baise, Guangxi 533000,China E-mail:yyhqc@sina.com)

　　Abstract: Objective To observe the effects of Atorvastatin on the expression of GRP78 and GADD153 proteins in rats with schemia/reperfusion injury, so as to explore the the endoplasmic reticulun stress signaling pathways for Atorvastatin in protection of myocardium. Methods 54 SD rats were randomly divided into the Atorvastatin intervention group (n=24): the rats were infused orally with Atorvastatin, 20 mg/(kg·d); the model control group (n=24): the rats were infused orally with 0.9% sodium chloride solution, 2ml/d; the pseudo-operation group (n=6): the rats were infused orally with 0.9% sodium chloride solution, 2ml/d. The schemia/reperfusion injury rats models were produced. The TUNEL kit was used to detect myocardial cells apotosis. The immunohistochemistry technique was used to detect GRP78 and GADD153 proteins. Results The Atorvastatin intervention group yielded less myocardial cells apoptosis at adjacent time points, compared to the model control group (P<0.01). At corresponding time point, the elevated GRP78 proteins were obtained in Atorvastatin intervention group, compared to the model control group (P<0.05), while the levels of GADD153 protein decreased significantly, compared to the the model control group (P<0.01 or P<0.05). Conclusion Via endoplasmic reticulun stress signaling pathways may be one of the mechanism of Atorvastatin in protection of myocardium in ischemia/reperfusion injury.

　　Key words: coronary disease; myocardial infarction; Atorvastatin; animals, laboratory

　　早期溶栓和急诊冠状动脉介入治疗(急诊PCI)是治疗急性心肌梗死(AMI)最有效方法，能使梗死相关血管再通，缺血心肌得到再灌注，缩小梗死面积，改善预后。然而，心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后常常出现的I/R损伤影响了再灌注的疗效。已有研究证实[1]，心肌缺血再灌注时诱导的细胞凋亡是急性心肌I/R损伤的主要形式，防止心肌细胞凋亡对保护I/R的心肌细胞具有重要的意义。内质网应激(ER stress，ERS)启动的凋亡途径是近年发现的一种新的凋亡途径，Nickson等[2]研究发现ERS参与I/R心肌损伤的病理过程。

　　阿托伐他汀用于心肌梗死的治疗，其作用机制除了与调脂作用有关外，还与抑制细胞凋亡等相关[3]。阿托伐他汀通过何种途径抑制细胞凋亡，目前尚未完全阐明。为此，笔者通过探讨阿托伐他汀对内质网应激经典标志物GRP78和GADD153[4]的影响，进一步探讨阿托伐他汀在急性心肌梗死中的保护机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组 健康清洁级雄性SD大鼠54只，体重280～330g，购自广西医科大学动物实验中心(许可证号：SCXK桂2003-0003)，随机分为阿托伐他汀干预组24只[阿托伐他汀(商品名立普妥，辉瑞制药公司)灌喂20mg/(kg·d)]、模型对照组24只(0.9%氯化钠溶液灌喂2ml/d)和假手术组6只(0.9%氯化钠溶液灌喂2ml/d)。灌喂3天后制作大鼠心肌I/R模型。阿托伐他汀干预组和模型对照组后2、6、24、48h分别分为4个亚组，每个亚组动物6只。

　　1.2 大鼠心肌I/R模型的制作 参照Bimbaum法[5]，大鼠以水合氯醛(35mg/100g体重)腹腔注射麻醉，观察呼吸及反应，稳定后固定于手术台。接心电图机，实验过程中动态观察并记录Ⅱ导联心电图，保持大鼠自然呼吸状态。气管插管，接人工呼吸机(频率55次/min，潮气量115ml/100g)。开胸，于冠状动脉左前降支起始0.2cm处穿线，待呼吸、血压平稳15min后，用一硅胶管垫于血管和结扎线之间，结扎，假手术组仅穿线不结扎。30min后剪开结扎线。结扎成功标志：结扎线远端心肌颜色紫绀，心电图表现为R波高耸或ST段抬高。模型制备成功标志：松开结扎线以恢复冠状动脉血量，缺血部位心肌颜色恢复，抬高的ST段下降。

　　1.3 心肌细胞凋亡的TUNEL法检测 各组大鼠再灌注后相应时间点麻醉、开胸，取左室前壁中间段梗死区边缘心肌组织0.5cm×0.1cm×0.1cm，10%甲醛室温固定，常规石蜡包埋、切片、脱蜡至水后，专人严格按TUNEL试剂盒(试剂盒购于博士德公司)说明书操作。中型树胶封片，显微镜下观察;在400倍镜下，计算10个不重叠视野TUNEL阳性细胞比例的平均值，并以百分数(%)表示凋亡指数(Apoptotic Index，AI)。

　　1.4 免疫组化检测GADD153和GRP78蛋白表达 各组大鼠再灌注后相应时间点麻醉、开胸，取心尖部约0.5cm×0.5cm×0.3cm，10%甲醛室温固定，常规石蜡包埋切片。采用SABC法检测GRP78和GADD153蛋白表达，严格按试剂说明操作。镜下观察阳性染色。

　　1.5 阳性细胞光密度值的检测 采用CMIAS2001B病理图像采集分析系统定量分析阳性细胞平均光密度值。

　　1.6 统计学分析 所有结果以(±s)表示，用SPSS 15.0统计软件对实验数据进行分析，采用单因素方差分析(ANOVA)。

　　2 结果

　　2.1 细胞凋亡的TUNEL检测 假手术组大鼠偶可见凋亡细胞，推测系生理性死亡的心肌细胞。模型对照组和阿托伐他汀干预组大鼠缺血再灌注2h缺血周围区可见少量凋亡细胞[分别为(5.32±1.45)%，(4.03±0.63)%];再灌注6h凋亡细胞有所增多;随着再灌注时间延长至24 h，凋亡细胞数量达高峰[分别为(60.50±9.35)%，(43.53±8.42)%]细胞核呈棕色或棕褐色着染，浓缩，致密，核形不规则，大小不一;再灌注48h凋亡细胞有所减少[分别为(38.25±7.73)%，(25.52±6.35)%]，相邻各时间点比较，阿托伐他汀干预组大鼠心肌细胞凋亡明显比模型对照组减少(t分别为3.99、6.61、6.24，P均<0.01)。

　　2.2 GRP78和GADD153的蛋白表达 假手术组大鼠心尖部相应区域心肌细胞未见明显GRP78阳性表达。模型对照组和阿托伐他汀干预组大鼠再灌注2h后心尖部GRP78表达开始增加，6h达高峰，24h时表达水平明显下降。GRP78阳性染色细胞呈棕黄色，主要位于胞浆，细胞形态相对饱满，呈圆形或椭圆形。在相应时间点，干预组的GRP78蛋白表达水平比模型对照组升高(P<0.05)，见图1。

　　假手术组大鼠心尖部相应区域心肌细胞未见明显GADD153阳性表达。模型对照组和阿托伐他汀干预组大鼠缺血周围区GADD153从再灌注6h开始在神经细胞内明显表达，并逐渐增强，于再灌注24～48h达高峰，GADD153阳性表达主要位于细胞核，呈棕黄色，胞浆可有淡染，多数阳性细胞发生形态学改变，胞核皱缩，呈梭形或条索状。但在相应时间点，干预组的GADD153的蛋白表达水平明显比模型对照组下降(P<0.01或P<0.05)，见图2。

　　3 讨论

　　内质网是细胞内调控钙稳态、蛋白质合成和细胞凋亡的重要亚细胞器，对应激刺激非常敏感[6]。内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)近年来备受高度关注，ERS与神经退行性变、糖尿病和心脑组织缺血梗死密切相关[7]。适度的ERS有利于细胞内钙和蛋白质加工等稳态恢复正常，增强细胞耐受应激刺激的能力;持续而严重的ERS则触发内质网相关性细胞凋亡(ER associated death, ERAD)，造成细胞损伤，ERAD途径主要包括capase-12剪切活化、CHOP/GADD153(C/EBP homologous protein/gene forgrowth arrest and DNA damage)表达上调，以及c-jun氨基末端激酶(c-Jun NH2 terminal kinases, JNK)途径的激活[8]。越来越多的动物模型和人体标本的证据证实凋亡在心肌缺血再灌注损伤病理生理学上是一个主要事件，目前普遍认为干预心肌细胞凋亡对防治心肌缺血再灌注损伤有着重要意义。GADD153是内质网相关促凋亡蛋白，在正常细胞中表达水平很低，而在内质网应激情况下被大量诱导表达，激活细胞凋亡途径。内质网分子伴侣GRP78(endoplasmic reticulummolecular chaperon GRP78)又称为Bip，其位于内质网，是内质网稳态的中心调节剂[9]，内质网应激时，GRP78与内质网中错误折叠和未折叠蛋白结合，恢复蛋白质正确构象，维持内环境稳定，因此GRP78在应激条件下对细胞起保护作用。

　　他汀类药物通过竞争性抑制胆固醇合成代谢中的关键限速酶，起到降低低密度脂蛋白胆固醇和升高高密度脂蛋白胆固醇的作用，近年来随着对他汀类药物的深入研究，其非降脂作用受到极大关注。研究发现他汀类药物非降脂外效应主要包括心肌保护作用，其作用机制可能与逆转心肌肥大、抑制心肌凋亡等有关[10]。本实验研究发现，阿托伐他汀抑制心肌缺血再灌注后的心肌细胞调亡，提示阿托伐他汀对心肌缺血再灌注损伤中起着保护作用。通过对内质网应激途径的经典标志物GRP78和GADD153的蛋白检测，我们发现阿托伐他汀促进心肌缺血再灌注后GRP78蛋白表达，同时观察到GRP78阳性染色细胞形态相对饱满，提示阿托伐他汀可能通过上调GRP78蛋白表达水平已对内质网应激反应启动后迅速发挥内质网自稳功能，细胞适应应激而存活。与此同时，阿托伐他汀抑制心肌缺血再灌注稍后期GADD153表达，多数GADD153阳性细胞形态学发生改变，胞核皱缩，呈梭形或条索状，提示阿托伐他汀对心肌缺血再灌注稍后期保护可能与下调GADD153表达水平。由于内质网应激途径比较复杂，阿托伐他汀还可能通过内质网应激其他途径，如PI3K/Akt/eNOS[11]途径等。

　　综上所述，阿托伐他汀通过内质网应激途径发挥在心肌再灌注后损伤的保护作用，促进心肌再灌注后GRP78的表达和下调GADD153表达水平可能是其中机制之一，是否对内质网应激其他途径的影响尚需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Kajstura J, Cheng W, Reiss K, et al. Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infarct size in rats [J]. Lab lnvest,1996,74 (1): 86-107.

　　[2] Nickson P, Toth A, Erhardt P. PUMA is critical for neonatal cardiomyocyte apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress [J]. Cardiovasc Res,2007,73(1):48-56.

　　[3] 孟红，张英杰.阿托伐他汀对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响[J].中国全科医学，2009，12(3B):465-468.

　　[4] Yoshida H, Haze K, Yanagi H, et al. Identification of the cis-acting endoplasmic reticulum stress response element responsible for transcriptional induction of mammalian glucose-regulated proteins. Involvement of basic leucine zipper transcription factors [J]. J Biol Chem,1998,273(50): 33741-33749.

　　[5] Bimbaum Y, Ashitkov T, Uretsky BF, et al. Reduction of infarct size by short-term pretreatment with atorvastatin [J]. Cardiovasc Drugs Ther,2003,17(1):25-30.

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　　[8] 祝筱梅，姚咏明，盛志勇.内质网应激与急性损伤后免疫反应[J].生理科学进展，2009，40(1)：51-54.

　　[9] Luo S, Mao C, Lee B, et al. GRP78/BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development [J]. Molecular Cellular Biology,2006,26(15):5688-5697.

　　[10] Hasegawa H, Yamamoto R, Takano H, et al. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors prevent the development of cardiac hypertrophy and heart failure in rats [J]. J Mol Cell Cardiol,2003,35(8):953-960.

　　[11] Smith RS Jr, Agata J, Xia CF, et al. Human endothelial nitric oxide synthase gene delivery protects against cardiac remodeling and reduces oxidative stress after myocardial infarction [J]. Life Sci,2005,76(21):2457-2471.