IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响

　　作者：王庸晋 王治平 石变华 胡耀东 姜 胜 魏 武 作者单位：1 长治医学院心血管病研究所，附属和平医院心血管内科(046000) 2 长治医学院内科学教研室

　　【摘要】 目的：研究IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响。方法：(1)复苏并培养人单核细胞株THP-1细胞并诱导为巨噬细胞和泡沫细胞。(2)RT-PCR法检测ACAT-1 mRNA在单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞以及泡沫细胞加IL-1和泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体中的表达。结果：(1)单核细胞株THP-1细胞被诱导为巨噬细胞和泡沫细胞。(2)与单核细胞比，巨噬细胞、泡沫细胞以及泡沫细胞加IL-1的ACAT-1 mRNA表达均明显增高，尤以泡沫细胞加IL-1中增高明显;与泡沫细胞加IL-1比，泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体的ACAT-1 mRNA表达下降。结论：(1)IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA的表达有上调作用，IL-1单克隆抗体可以拮抗这种效应。(2)IL-1可上调ACAT-1 mRNA表达水平，可能是巨噬细胞脂质过负荷后ACAT-1上调的始动因子之一。

　　【关键词】 IL-1;泡沫细胞;脂酰CoA胆固醇酯酰转移酶-1

　　Effects of IL-1 on the ACAT-1 mRNA Expression in the Mononuclear

　　Cells Differentiation to Foam Cells

　　Wang Yongjin, Wang Zhiping，Shi Bianhua,et al.

　　Department of Cardiology,Heping Hospital Affiliated to Changzhi Medical College

　　Abstract Objective:To explore the effects of ACAT-1 mRNA expression in the differentiation from the mononuclear cells to the foam cells.Methods:(1)The mononuclear cells line THP-1 was induced resuscitation and cultured and induced into differentiation to macropahges and differentiation to the foam cells.(2)RT-PCR assay were employed to examine the expression of ACAT-1 mRNA in different groups.Results:(1)The mononuclear cells line THP-1 was induced into differentiation to macropahges and to the foam cells.(2)The expressions of ACAT-1 mRNA in the foam cells group and the foam cells IL-1 group are higher than in the mononuclear cells group and the macrophages group,especially in the foam cells IL-1 group.Compared the foam cells IL-1 group with the foam cells IL-1/IL-1 monoclonal antibody group, ACAT-1 mRNA expression of the latter were significantly decreased.Conclusion:(1)IL-1 can up-regulate the expression of ACAT-1 mRNA during the mononuclear cells differentiation into the foam cells,and IL-1 mAb may retard the effect.(2)The up-regulation effects of IL-1 on the ACAT-1 mRNA expression presented in the experiment.IL-1 may be the initiation factor switching on ACAT up-regulation in MP lipid overloading.

　　Key words IL-1;Foam cells; Acyl-CoA:Cholesterol O-Acyltransferase-1

　　ACAT是调节体内胆固醇代谢平衡的关键蛋白之一。它是体内许多组织细胞催化脂肪酸酰基辅酶A和胆固醇生成胆固醇酯的一种酶。正常生理条件下，它可避免由于游离胆固醇过多对细胞造成伤害，对胆固醇的吸收和代谢平衡起重要调节作用。但在病理条件下，它会造成过多的胆固醇酯被动脉壁巨噬细胞和平滑肌细胞无限制地摄取堆积，在动脉粥样硬化的早期过程中起着重要的作用[1]。ACAT有2种亚型：ACAT-1和ACAT-2，与动脉粥样硬化形成有关的为ACAT-1，泡沫细胞形成过程中ACAT-1活性明显上调，因此，深入探讨ACAT-1在单核细胞转变为泡沫细胞过程中的作用，对于阐明动脉粥样硬化的发病机制具有重要的理论指导意义。

　　在本研究中应用RT-PCR方法，观察单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中，不同细胞组中ACAT-1 mRNA水平，探讨ACAT-1上调的环节和IL-1与ACAT-1的关系并分析其作用机制。

　　1 材料

　　.1 主要试剂

　　单核细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心，IL-1 alpha(蛋白)与IL-1 alpha(抗体)购自AMS 公司，cDNA 合成试剂盒购自TOYOBO公司 ，DNA Marker购自TaKaRa公司，ACAT上游引物：5’-GGCTTACCTATTTCTACTCCA-3’，下游引物：5’-ACATCAGTTAGCCCGTCTT-3’，扩增片断长度: 227 bp;GAPDH上游引物:5’TCCCTCAAGATTCTCAGCAA 3’，下游引物: 5’AGATCCACAACGGATACATT 3’扩增片段长度：450 bp。

　　1.2 主要仪器

　　电热恒温细胞培养箱(天津泰斯特仪器有限公司)，PCR仪UNOⅡ(Biometra公司)，DG-Ⅲ双稳数显电泳仪(武汉英贝科学仪器有限公司)。

　　2 方法

　　2.1 实验细胞分组

　　单核细胞组，单核细胞无血清培养48 h;巨噬细胞组，单核细胞+PMA培养48 h;泡沫细胞组，巨噬细胞+Ox-LDL培养24 h;泡沫细胞IL-1组，巨噬细胞+Ox-LDL+IL-1共培养24 h;泡沫细胞IL-1/anti-IL1组，巨噬细胞+Ox-LDL+IL-1+Anti-IL1共培养24 h。

　　2.2 单核细胞株的复苏、培养与诱导分化

　　2.3 RNA的提取

　　按说明书方法进行RNA提取。

　　2.4 反转录

　　按照ReverTra Ace-α-TM试剂盒说明进行。

　　2.5 PCR扩增

　　按照TaKaRa Tap TM试剂盒说明生成20 μL PCR反应体系，PCR扩增程序：95 ℃反应5 min，94 ℃反应30 s，54 ℃反应30 s，72 ℃反应30 s，72 ℃ 5 min，其中94 ℃，54 ℃和72 ℃条件下循环35次，最后置于4 ℃。

　　2.6 产物用琼脂糖凝胶电泳检测

　　扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10 μL ,电压120 V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色，在紫外灯下观察结果并照相。

　　2.7 统计学处理

　　实验数据用SPSS统计软件进行分析，实验结果以均数±标准差(x±s)表示，各组数据间的统计采用方差分析，P<0.05为显著性差异。

　　3 结果

　　3.1 单核细胞培养后形态学

　　单核细胞复苏后，倒置显微镜下观察，单核细胞株THP-1细胞在含10%FBS的RPMI 1640培养基中悬浮，呈圆形，非贴壁形式生长、增殖，48 h后细胞体积增大，可见细胞核及细胞器(见图1)。

　　3.2. 单核细胞株THP-1用PMA诱导后形态学变化

　　单核细胞THP-1用PMA诱导后，由悬浮式生长变成贴壁生长，由圆形变成不规则形态，体积进一步增大，细胞浆疏松，细胞核增大明显，可见大量明显细胞器，胞膜周围可见少量突起(见图2)。

　　3.3 单核细胞源性巨噬细胞用Ox-LDL诱导后形态学变化及油红O染色

　　单核细胞源性巨噬细胞用Ox-LDL诱导24 h后，倒置显微镜下观察，巨噬细胞体积进一步增大，细胞膜突触形成明显，胞浆增加，疏松化，可见大量细胞器及吞噬的脂质小滴，油红O染色后，细胞浆内可见大量红染物质(见图3)。

　　3.4. 不同细胞ACAT-1 mRNA表达

　　ACAT-1 mRNA在单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞、泡沫细胞加IL-1和泡沫细胞加IL-1/Anti-IL1中的表达分别为0.517±0.02、0.902±0.03、0.957±0.02、0.976±0.03和0.632±0.01。与单核细胞比，巨噬细胞ACAT-1 mRNA表达上调(P<0.05),泡沫细胞中ACAT-1 mRNA表达明显上调(P<0.01)，泡沫细胞加IL-1表达明显上调(P<0.01)，泡沫细胞加IL-1/Anti-IL1上调不明显(P>0.05)，见图4～图7。

　　王庸晋等.IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响

　　图4～图6为各组细胞ACAT-1mRNA表达的RT-PCR电泳图，ACAT-1基因扩增产物为227 bp，内参GAPDH基因扩增产物为450 bp。图4、图5中的7及图6中7、15、23分别代表单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞、泡沫细胞加IL-1和泡沫细胞加IL-1/Anti-IL1中的ACAT-1mRNA表达;图4、图5中的8及图6中8、16、24分别为相应细胞GAPDHmRNA表达。

　　图7为单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1mRNA表达的分析图。ACAT-1mRNA表达量以ACAT-1 mRNA与内参GAPDH的IOD比值来表示，1、2、3、4、5分别代表单核细胞组、巨噬细胞组、泡沫细胞组、泡沫细胞加IL-1组和泡沫细胞加IL-1/Anti-IL1组。

　　4 讨论

　　动脉粥样硬化是严重威胁人体健康的疾病。其早期的重要病理改变之一是血液单核细胞(monocyte, MC)在血管内皮细胞功能受损时迁移到内皮下，分化为巨噬细胞(macrophage cell, MP)，并且摄取大量脂质转变为泡沫细胞(foam cell, FC)，FC在血管壁内是动脉粥样硬化早期形成脂质条纹的主要原因[2]。

　　早有研究发现FC内脂滴存在的主要脂质是胆固醇酯(cholesterol ester, CHE)，它是胆固醇(cholesterol, CH) 的储存形式，由胆固醇在脂酰CoA胆固醇酯酰转移酶(Acyl-CoA: cholesterol acyltransferase,ACAT)催化下而产生[3，4]。ACAT已发现2 种形式ACAT 存在(ACAT-1, ACAT-2),单核或巨噬细胞内主要以ACAT-1形式存在[5]。 在我们的研究中，单核细胞株THP-1经PMA和Ox-LDL诱导后，可分化为巨噬细胞、泡沫细胞。我们检测了在单核细胞诱导分化为泡沫细胞的过程中，不同阶段细胞内ACAT-1 mRNA的水平。观察到巨噬细胞组与单核细胞组相比较ACAT-1 mRNA水平升高(P<0.05)，泡沫细胞组与单核细胞组比较，ACAT-1 mRNA表达明显升高(P<0.01)，证明在单核细胞转化为泡沫细胞的过程中，无论有无细胞因子干预，均伴随着ACAT-1 mRNA表达明显升高。

　　泡沫细胞加IL-1组与单核细胞组比，ACAT-1 mRNA表达明显升高(P<0.01)，泡沫细胞加IL-1/Anti-IL1组与单核细胞组比，ACAT-1 mRNA表达无显著性差异(P>0.05)，与泡沫细胞加IL-1比，泡沫细胞加IL-1/Anti-IL1的ACAT-1 mRNA表达下降，表明IL-1可上调泡沫细胞中ACAT-1 mRNA表达，Anti-IL1可以拮抗IL -1上调ACAT-1 mRNA表达的效应。

　　IL-1可诱发包括动脉粥样硬化在内的多种心血管疾病[6]。最近发现IL-1可刺激巨噬细胞合成胆固醇酯，这种作用可被蛋白合成抑制剂放线菌酮所阻断，提示这种作用是通过诱导ACAT的合成实现的。有实验[7]表明粥样斑块处的Ox-LDL可促使单核细胞释放IL-1β，而IL-1β通过促使细胞中的ACAT-1mRNA的表达，使胞内胆固醇酯化和聚积，促使肌源性泡沫细胞的形成并参与动脉粥样硬化的形成和发展。

　　有实验[8]证明,人THP-1细胞分化成巨噬细胞后，ACAT-1 mRNA和蛋白水平及活性增加,印证了ACAT-1在泡沫细胞形成中的关键地位。我们的实验也证明IL-1可能是巨噬细胞脂质过负荷后启动ACAT-1上调的始动因子之一，IL -1可在转录水平上调ACAT-1 mRNA表达，使细胞内胆固醇酯化和聚集，促使泡沫细胞的形成，参与动脉粥样硬化的形成和发展。

　　【参考文献】

　　[1] Friedrich K, Kammer W, Erhardt I. Activation of STAT5 by IL- 4 relies on Janus kinase function but not on receptor tyrosine phosphorylation, and can contribute to both cell proliferation and gene regulation. Int Immunol, 1999,11(47):1　283～1　294.

　　[2] Rho MC, Lee HS, Lee SW,et al.Polyacetylenic compounds, ACAT inhibitors from the roots of Panax ginseng.J Agric Food Chem,2005,53(4)：919～922.

　　[3] Mendelsohn ME, Loscalzo J. Role of platelets in cholesterol ester formation by U-937 cells. J Clin Invest,1988，81:62～68.

　　[4] Curtiss LK, Black AS, Takagi Y,et al.New mechanism for foam cell generation in atherosclerotic lesions. J Clin Invest, 1982, 80:367～373.

　　[5] Buhman KF,Accad M,Farese RV. Mammalian acyl-CoA :cholesterol acylt ransferases.Biochim Biop hy Acta,2000,15:142～154.

　　[6] Sakashita N, Miyazaki A, Takeya M,et al.Localization of human acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase-1 (ACAT-1) in macrophages and in variens tissues.Am J Pathol,2000, 56(1):227～236.

　　[7] Lougheed M,Steinbrecher UP. Mechanism of uptake of copper - oxidized low density lipoprotein in macrophages is dependent on its extent of oxidation. J Biol Chem,1996,271(20):11　798～11　805.

　　[8] 柯 丽，成 蓓，余其振,等.牛磺酸下调单核/巨噬细胞ACAT-1表达.临床心血管病杂志,2005,21(5):299～301.