甘肃汉族、回族冠心病患者E选择素水平及基因多态性研究

　　作者：马华 马丽雅 王迎梅 高江霞 作者单位：甘肃省人民医院心内科，甘肃 兰州 730000

　　【摘要】 目的 研究中国甘肃汉族、回族人群E选择素基因第2外显子G98T和第4外显子S128R多态性与冠心病的相关性，以及对血清E选择素水平的影响。方法 采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCRRFLP)技术，分别检测甘肃汉族、回族冠心病患者108例、42例及两民族健康对照者96例、50例。检测他们的E选择素基因多态性，同时采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测冠心病患者和对照者血清E选择素水平。结果 E选择素基因S128R基因频率和等位基因频率在两民族冠心病组和对照组比较差异有显著性(P<0.05)。 SR基因型携带者的E选择素血清水平明显高于SS基因型者(40.26±3.61 vs 22.21±4.23)(P<0.01)。E选择素G98T各基因型分布在两民族冠心病组和对照组之间比较差异无显著性(P>0.05)。结论 E选择素S128R基因多态性与冠心病的发病有关联，并可影响血清E选择素的水平，R等位基因可能是冠心病的候选基因，E选择素基因G98T多态性在冠心病的发病中可能不起直接重要作用。

　　【关键词】 冠状动脉疾病 E选择素 基因多态现象(遗传学)

　　Study of Eselectin level and gene polymorphism of Han and Muslim nationality patients with coronary heart disease in Gansu

　　MA Hua, MA LiYa, WANG YingMei, et al.

　　Department of Cardiology, Gansu Provincial People's Hospital, Lanzhou 730000, Gansu, China

　　【Abstract】 Objective To study the relationship between the polymorphism of the second and fourth exon G98T and S128R of Eselectin and coronary heart disease (CHD) and its effect on Eselectin level of Han and Muslim nationality.Methods The polymorphism and level of Eselectin of 108 CHD patients and 42 healthy people of Han and Muslim nationality in Gansu were determined by PCRRFLP and ELISA respectively.Results There was significant difference in the frequencies of S128R and allele between CHD and control group (P<0.05). Eselectin level of SR genotype carriers (40.26±3.61 )was significantly higher than that of those with SS (22.21±4.23)(P<0.01). There was no significant difference in G98T genotype distribution between CHD and control group (P>0.05).Conclusions S128R gene polymorphism of Eselectin might be related to CHD, could influence Eselectin level. R allele might be candidate gene of CHD. G98T polymorphism of Eselectin could not play directly important role in CHD.

　　【Key words】 Coronary heart disease (CHD);Eselectin;Polymorphism

　　有研究认为血中白细胞黏附分子可作为动脉粥样硬化的分子标记，尤其是E选择素，它与颈动脉粥样硬化和冠心病呈强相关性〔1，2〕。炎症反应的激活可能是导致动脉粥样斑块不稳定的主要因素，然而具体的发病机制尚无定论，多数学者认为与遗传因素关系密切〔3〕。本研究采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)法，研究甘肃地区汉族与回族冠心病患者的E选择素基因多态性，试图从分子遗传学角度探讨E选择素的基因多态性与冠心病的相关性及对血清E选择素水平的影响。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 冠心病组

　　汉族108例来自2004-2006年我院心内科住院病人，平均年龄(65.4±8.2)岁。回族42例，为临夏州、市医院2004-2006年住院病人，平均年龄(69.8±9.1)岁。

　　1.1.2 对照组

　　汉族96例为我院健康体检人群，平均年龄(66.1±8.3)岁，回族50例，为临夏州医院健康体检人群，平均年龄(67.8±9.5)岁。 所有冠心病患者及对照者均为男性。

　　冠心病诊断均为既往有陈旧性心肌梗死病史或急性心肌梗死病史或冠状动脉造影证实者。对照组人群无心血管病史、体检及心电图均正常。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 引物设计与合成

　　引物由上海生工生物制品公司合成、提供。

　　用于特异性扩增E选择素基因包含128位点的一段DNA，引物序列为：P1：5′AGTAATAGTCCTCCTCATCATG3′，P2：5′ACCATCTCAAGTGAAGAAAGAG3′，用于特异性扩增E选择素基因包含98位点的一段DNA引物序列为：P1：5′TGCCCAAAATCTTAGGATGC3′，P2：5′AAGCCCAGGGAAGAACACAT3′。

　　1.2.2 人类基因组DNA提取

　　参照已建立的改良碘化钠法〔4〕。

　　1.2.3 PCR扩增条件 E选择素的PCR扩增反应体系均为25 μl，其中含10×PCR Buffer 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μl，引物P1、P2各20 pmol，模板DNA 5.0 μl，TaqDNA聚合酶1.25 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至25 μl。置热循环仪中94℃预变性5 min，再按下列程序循环35次，即94℃变性30 s，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，末次循环后，72℃延伸5 min。

　　1.2.4 扩增产物的限制性酶切

　　分别取PCR扩增产物10 μl，用10 U限制性内切酶Pstl酶切E选择素基因S128R位点，用2 U的限制性内切酶HphⅠ酶切E选择素的基因G98T位点，37℃孵育3 h，反应终止后，消化片断在3%的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，染色后通过法国VL凝胶成像系统判断结果。

　　1.2.5 冠心病患者和对照者血清

　　E选择素水平检测 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定E选择素血清水平，试剂盒由上海生工生物制品公司提供，测定均严格按说明书操作。

　　1.3 统计学分析

　　用SPSS11.0软件包进行分析。基因型及等位基因频率采用基因计数法计算，研究对象与Hardy Weinberg平衡的符合程度、单个基因型及组间等位基因频率比较采用四格表χ2检验，并与比值比(OR)及其95% 可信区间(CI)表示相对风险度。计量资料用x±s表示，各组间数据比较依据资料的性质用t检验、方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 一般临床资料

　　4组均为男性，年龄匹配。4组吸烟者(包括现在吸烟和过去吸烟现已戒烟)和饮酒者的比例差异无显著性。两组冠心病患者排除其他心脏病史，糖尿病史等。

　　2.2 E选择素的基因型分析

　　包含128位点的E选择素PCR扩增产物片段大小为186 bp，根据限制内切酶PstⅠ酶切片段的情况，基因型有三种，SS型(123，63 bp 2条带)，SR型(186，123，63 bp 3条带)，RR型(186 bp 1条带，本研究检测到汉族冠心病患者1例)。包含98位点的E选择素PCR扩增产物片段大小332 bp，根据限制性内切酶HphⅠ酶切片段的情况基因型有三种：GG型(194，138 bp 2条带)，GT型(332，194，138 bp 3条带)，TT型(332 bp 1条带，本研究未检出)(图1，2)。

　　2.3 E选择素基因型与冠心病的相关性分析

　　E选择素的基因型在四组人群中分布频率，经Hardy Weinberg遗传平衡定律检验，达到遗传平衡，具有群体代表性。经χ2检验及相关分析，S128R基因型在甘肃汉族冠心病、回族冠心病及对照组中的分布差异有显著性(χ2=4.509，P<0.05)(χ2=3.98，P<0.05)。汉族SR基因型患冠心病的风险是SS基因型的2.62倍(OR=2.62 95%CI：1.138～6.033)。等位基因频率在汉族冠心病及汉族对照组中也存在显著差异(χ2=4.613，P<0.05，OR=2.51 95%CI：1.023～5.788)。在回族冠心病患者中SR基因型患冠心病的风险是SS基因型的3.6倍(OR=3.6 95%CI：1.972～7.131)等位基因频率在回族冠心病及回族对照组中也存在显著差异(χ2=3.87，P<0.05，OR=3.17 95%CI：2.006～7.541)。G98T基因型在四组中的分布差异无显著性(P>0.05)(表1)。表1 汉族、回族冠心病组和对照组E选择素基因多态性分布及其与冠心病风险之间的关系〔n(略)〕

　　2.4 E选择素血清水平比较

　　E选择素血清水平汉族冠心病组(31.35±9.23)μg/L与对照组(23.39±8.55)μg/L，回族冠心病组(32.53±10.18)μg/L与对照组(24.29±8.75)μg/L比较差异均具有显著性(P<0.01)(表2)。汉族冠心病组SR基因型携带者的E选择素血清水平高于SS基因型〔(40.26±3.61)μg/L vs (22.21±4.23)μg/L，P<0.01〕，回族冠心病组SR基因携带者的E选择素血清水平显著高于SS基因型〔(39.12±5.44)μg/L vs (20.98±6.71)μg/L P<0.01〕。E选择素的血清水平在GG与GT基因型之间比较无显著差异(P>0.05)(表3)。表2 各组E选择素血清水平比较(略)表3 汉族、回族冠心病组不同基因型E选择素水平比较(略)

　　3 讨 论

　　1994年德国Wenzel等〔3〕首先报道了E选择素第4外显子的561位A→C突变，并导致所编码的第128位氨基酸由丝氨酸变成精氨酸(Ser128Arg即S128R)，由此可能影响E选择素的生物学活性，1996年Wenzel等〔5〕又报道了E选择素基因第2外显子存在G/T多态性，这两种基因多态性与冠心病的发病可能有关联，并且这种关联与种族有关。

　　E选择素是黏附分子选择素家族的主要成员之一，为细胞表面糖蛋白，主要由肿瘤坏死因子、白介素1、细菌脂多糖等激活的血管内皮细胞合成并释放。它是体内的一种促炎细胞因子，参与多种细胞(包括粒细胞，巨噬细胞，单核细胞等)及CD4+记忆T细胞亚群的黏附聚集作用，参与动脉粥样硬化的形成。分子遗传学研究表明，人E选择素基因位于第1号染色体臂上，为一段长13 kb的DNA序列，含14个外显子和13个内含子〔6〕。有研究证实E选择素基因第2和第4外显子分别存在G/T和S/R多态性，这种基因多态性的存在可能影响E选择素基因表达和功能，进而影响到体内E选择素的生物学作用。

　　随着基因的分子生物学及分子遗传学研究的不断深入，对冠心病的发病机制也有了更进一步的理解。目前认为冠心病是一种多因素、多基因疾病。而遗传因素在冠心病的发生发展中起着不可忽视的作用。基因多态性存在种族、地域和个体差异。李艳等〔6〕研究发现中国汉族人群存在这种基因多态性。但甘肃汉族及回族人群中是否存在这种基因多态性，且这种基因多态性是否影响E选择素的血清水平表达及与冠心病是否相关，尚无报道。

　　在人粥样硬化斑块处，E选择素的表达增加〔7〕，冠心病患者血清可溶性E选择素也有不同程度的升高〔8〕。本研究显示，冠心病组无论是汉族还是回族可溶性E选择素水平明显高于对照组，和国外文献报道一致〔8〕。本研究也发现甘肃汉族回族人群中存在E选择素的S128R基因多态性，这种基因多态性影响E选择素血清水平。携带SR基因型患者E选择素血清水平明显高于SS基因型者，提示S128R基因多态性可能是通过影响E选择素在内皮细胞上的表达，基因结构的改变可能带来蛋白质功能的变化而影响到冠心病的发生发展。同时研究还发现S128R基因多态性与冠心病易患性相关联，携带SR基因型者患冠心病的风险明显高于SS基因型者，提示R等位基因可能是冠心病的危险因素之一。本研究显示：在冠心病患者中无论是汉族还是回族，S128R基因多态性的结果一致。因此提出R等位基因可能是冠心病的候选基因，S128R基因多态性与冠心病的发生发展可能相关。

　　【参考文献】

　　1 B Lann AD.Soluble Eselectin and soluble intercellar adhesion molecule1 in coronary artery disease〔J〕.Cardivasc Res,1998;37:8267.

　　2 Semaan HB，Gurbel PA，Anderson JL,et al.Soluble Vcam1 and Eselectin，but not ICAM1 driscriminate endothelial injury in patients with documented coronary disease〔J〕.Cardiology，2000;93：710.

　　3 Wenzel KL，Felix S，Kleber FX,et al.Eselectin polymorphism and atherosclerosis;an association study〔J〕.Hum Mol Genet,1994;3:19357.

　　4 李 艳，黄宪章，张平安，等.雌激素受体基因多态性与急性心肌梗死关系的研究〔J〕.中华医学杂志，2001;81(7):38992.

　　5 Wenzel K,Ernst M，Rohdek,et al.DNA polymorphisms in adhesion molecule genesa new risk factor for early atherosclerosis〔J〕.Hum Genet,1996;97:3520.

　　6 李 艳，韦叶生，张平安，等.冠心病患者E选择素血清水平及G98T.S128R基因多态性研究〔J〕.中华心血管病杂志，2004;32(3)：22932.

　　7 DaviesMJ，Gordon JL，Geating AJ,et al.The experession of the adhesion moleculer LCAM1,VCAM1,PECAM and Eselectin in human atherosclerosis〔J〕.pathol,1998;171:2239.