CD151基因转移对大鼠缺血心肌VEGF表达影响的实验研究

　　作者：郑振中 梁静 王梦洪 郑泽琪 彭景添 魏云锋 刘正湘 作者单位：南昌大学第一附属医院心血管内科，江西 南昌 330006

　　【摘要】目的 通过将携带人CD151基因的重组腺病毒相关病毒(rAAV) 载体注入缺血心肌， 观察CD151对缺血心肌VEGF表达的影响。方法 制作大鼠急性心肌梗死模型,将rAAVCD151注入缺血心肌。4 w后取注射部位心肌,用逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)检测外源性CD151 mRNA的表达、Western印迹法检测CD151及VEGF的表达情况，了解高表达CD151对VEGF表达的影响。结果 术后4 w，CD151组心肌组织检测到外源性CD151 mRNA的表达，假手术组、对照组、GFP组未检测到外源性CD151 mRNA的表达，且CD151组心肌组织CD151蛋白表达水平高于假手术组、对照组、GFP组(均P<0.05);CD151组VEGF表达无明显增加，与对照组、GFP组比较无明显增加(均P>0.05)。结论 rAAVCD151可以有效转染大鼠心肌组织,促进缺血心肌的血管生成，改善左室功能,但对VEGF表达没有影响。

　　【关键词】 CD151 心肌梗死 血管内皮细胞生长因子

　　The effect of CD151 gene delivery on the expression of VEGF in rat myocardial infarction model

　　ZHENG ZhenZhong, LIANG Jing, WANG MengHong, et al.

　　Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital, Nanchang University, Nanchang 330016, Jiangxi, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of CD151 gene divery on VEGF in rat myocardial infarction (MI) model. Methods Rat MI model was made by ligation of anterior descending coronary artery, and rAAVCD151 was injected into the ischemic myocardium. At 4 w after coronary artery ligation, human CD151 mRNA was detected using RTPCR, Western blot analysis for CD151,VEGF were performed.Results Human CD151 mRNA was detected in rAAVCD151 group. Compared with rAAVGFP and control groups, CD151 gene delivery significantly increased the expression of CD151 after MI (P<0.05), but did not affect the expression of VEGF(P>0.05). Conclusions CD151 could promote angiogenesis after MI in rats and improve left ventricular function, but VEGF is not involved in the process.

　　【Key words】 CD151; Myocardial infarction; Vascular endothelial growth factor (VEGF)

　　Tetraspanins在哺乳动物的细胞或组织中广泛表达，对细胞黏附和迁移的调节是这一家族最重要的特性，其中与整合素作用最为密切的Tetraspanins成员为CD151， 其高表达于上皮细胞、内皮细胞、血小板、巨核细胞及一些未成熟造血细胞。CD151具有促进大鼠后肢缺血模型血管新生的作用〔1〕。rAAV 载体携带CD151基因注入大鼠缺血心肌,能够在缺血心肌中有效表达CD151 mRNA及其蛋白,并能明显增加大鼠缺血心肌局部毛细血管密度,促进缺血心肌的血管生成，改善心室功能，但其分子机制仍不清楚〔2，3〕。本研究探讨CD151基因转移对VEGF表达的影响及CD151作用的分子机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 pZeoSVCD151由美国Tennessee大学馈赠。pAAVGFP由美国北卡罗莱那州立大学基因治疗中心馈赠。大肠杆菌E.coli Dh5α菌株购自美国Invitrogen公司。脐静脉内皮细胞株购于武汉大学物种保藏中心。质粒pAAVCD151由本实验室构建。Realtime PCR Master Mix购于日本TOYOBOCO公司。PVDF膜购自美国Life Science公司;化学发光试剂ECL购于Pirce公司;兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体及相关免疫组化试剂均购自北京中山生物技术有限公司;鼠抗人CD151抗体购自Serotec公司;βactin抗体购自美国Santa Cruz公司;辣根过氧化酶偶联羊抗兔IgG抗体购自Jackson公司;蛋白质提取试剂Trizol购自美国Life technologies公司;预染蛋白质分子量标准购自BioRad公司。Western Blot设备(Biorad)，Western印迹显色液(Pierce Biotechnology)，密度扫描分析(GeneTools分析软件)3Power Lab系统(美国Adinstrument公司)。按照三质粒共转染方法在人胚肾上皮细胞系(293细胞)包装和复制生成rAAVCD151和rAAVGFP病毒,并用RTPCR法测定病毒滴度〔1，4〕。

　　1.2 心肌梗死模型的制备、分组和基因导入 健康成年雄性SD大鼠(清洁级,同济医学院动物学部提供),体重200～250 g,随机分为假手术组、对照组、GFP组、CD151组。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)进行麻醉,气管插管,呼吸机辅助呼吸。开胸，暴露心脏。假手术组不结扎冠状动脉前降支，其他组均行左冠状动脉前降支结扎术。

　　结扎左冠状动脉前降支后,心尖部及左室前壁心肌变紫。1 ml注射器在变紫心肌边缘垂直心肌注射4×1011v.g rAAVCD151(CD151组)，rAAVGFP(GFP组)外源基因或等量生理盐水(对照组),分5点注射,每点相距7 mm。对照组和假手术组注入相同体积的生理盐水。关闭胸腔,监护至动物恢复自主呼吸,拔管,清醒后送回动物室饲养。

　　1.3 RTPCR 检测CD151 mRNA水平的表达 术后4 w处死动物,取梗死边缘区心肌组织置液氮中冻存，同时设置rAAVCD151转染的ECV304为阳性对照，蒸馏水作为阴性对照。分别提取心肌组织和ECV304的总RNA。紫外分光光度计定量。 取总RNA 2 μg 进行逆转录。取逆转录产物1 μl 进行PCR 反应,以βactin 为内参照。人CD151的PCR引物:上游引物:5GAGGTCTATGGGTGAGTTCAACGAG3，下游引物：5AATTCCTAGGCGTAGTC3;扩增片段长度为799 bp。βactin引物序列如下:上游引物:5GGAGAAGGACCCAGATC3,下游引物：5GATCTTCATGAGGTA GTCAG3;扩增片段长度为300 bp。PCR 反应体系25μl,反应条件为:94℃预变性5 min,然后94℃,1 min;60℃,1 min;72℃,40 s;共30个循环。72℃延伸3 min，取10 μl PCR产物,1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果进行计算机图像分析。

　　1.4 Western印迹法测定VEGF表达 术后4 w处死动物,取注射部位心肌组织,在冰浴的裂解缓冲液中研碎成匀浆,4℃,12 000 g 离心30 min，吸取上清。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。每组取约40 μg蛋白质在12%SDSPAGE凝胶上电泳分离,4℃下电转移至PVDF膜上。室温下用含5%的脱脂奶粉TBST溶液(10 mmol/L TrisHCl pH7.5,100 mmol/L NaCl,0.1%Tween20)封闭。PVDF膜与抗体4℃孵育过夜,而后与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育2 h。用化学发光试剂ECL按试剂说明书要求显影、曝光,并用凝胶成像分析系统灰度扫描来定量检测蛋白质的相对表达量。各组数据均用相应βactin进行标准化处理。

　　1.5 统计学处理 计量资料结果均以x±s表示。Western印迹法的结果用凝胶成相分析系统测定蛋白条带的相对光密度值，每组实验均重复3次，用t检验进行差异显著性分析。对校正的OD值进行单因素方差分析,两组间计量资料比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 RTPCR检测大鼠外源性CD151 mRNA的表达 基因转染4 w后，通过RTPCR检测转染的外源CD151基因在体内的表达。本实验设计在CD151基因的下游连接了一段长30 bp编码的HA基因片段，该基因片断不影响CD151蛋白质的表达和功能。PCR过程中所用的上游引物与CD151基因的起始段匹配，下游引物与HA尾端匹配，故PCR产物来自外源CD151基因的mRNA。

　　RTPCR结果显示(图1)，CD151组和阳性对照组(ECV304细胞提取物)可见特异性CD151条带和βactin 条带。这说明外源CD151基因在CD151组大鼠的心肌组织中得到了表达。而在假手术组、对照组、GFP组大鼠组织中只见到1条βactin 条带，说明在假手术组、对照组、GFP组的局部心肌组织中未见外源CD151基因的表达。结果提示rAAV载体携带的CD151基因在实验组动物体内长期稳定表达。

　　1.Marker;2.阴性对照组(ddH2O);3.假手术组;4.对照组;5.GFP组;6.CD151组;7.阳性对照组(ECV304细胞提取物)

　　图1 CD151基因在大鼠心肌组织中的表达(略)

　　2.2 大鼠心肌中CD151蛋白表达的检测 转染CD151基因4 w后，取各组大鼠心肌组织，进行CD151及PI3K/Akt通路相关蛋白表达的检测。结果显示各组大鼠心肌组织均出现特异性条带，假手术组、对照组、GFP组条带较窄且颜色较浅，CD151组呈现宽且颜色深的条带 (图2A)。CD151组大鼠 CD151蛋白质表达明显增加，CD151组与假手术组、对照组、GFP组比较表达有明显差异(P<0.05)，假手术组、对照组、GFP组比较表达没有显著性差异(P>0.05)(图2B)。说明人CD151基因的导入可明显增加CD151蛋白质的表达。

　　图2 CD151蛋白质表达的鉴定(略)

　　2.3 大鼠心肌中VEGF表达情况 为了阐明VEGF是否参与CD151诱导的大鼠心肌梗死模型的血管新生，笔者检测了VEGF的表达。结果发现高表达的CD151并不影响VEGF的表达(P>0.05)(图 3)。

　　图3 大鼠心肌中VEGF表达的Western印迹分析(略)

　　3 讨论

　　血管新生治疗已成为冠心病治疗的基础和临床研究热点。心肌梗死后血运重建在心功能恢复中起着关键作用，梗死区域血管新生可减少肥厚心肌细胞凋亡、维持心肌细胞活性及抑制胶原沉积，从而保护心脏功能，改善远期预后。血管新生是一个复杂的过程,血管形成是原有血管芽生新血管的过程，包括内皮细胞增生和迁移、蛋白溶解酶表达调控、细胞外基质破裂重建和内皮管腔形成。

　　VEGF是一种高度特异的、强烈的血管内皮细胞促分裂因子，它能促使生理或病理性的血管生成，是体内血管生成的重要调控物质。VEGF可激活有丝分裂原激活的激酶、压力激活的激酶、蛋白激酶C和Akt通路，导致机体产生血管基底膜分解所需的蛋白酶及特异性的整合素，最终引起细胞增殖和细胞迁移，促进细胞生存、增殖和血管新生;激活金属蛋白酶、黏附斑激酶和PI3K，诱导内皮细胞迁移〔5～11〕。本研究发现高表达的CD151并不影响VEGF的表达，说明CD151对血管新生的影响并不是通过VEGF实现的。

　　CD151基因转移可使CD151蛋白在大鼠梗死心肌中有效表达并可产生明显促血管新生效应和改善左室功能。CD151的作用机制目前还不十分清楚，是否伴随VEGF的高表达?仍然不清楚。在此，笔者通过Western印迹检测VEGF的表达，探讨其促进心肌梗死后大鼠心肌血管生成、心功能影响的作用机制，结果发现转染CD151基因可以上调CD151表达，但不影响VEGF的表达。

　　本研究明确了CD151促进缺血心肌血管新生的作用不是通过VEGF实现的，但尚有诸多问题需要探讨，如CD151促血管生成过程中其他促血管生成分子的变化等。

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