血管紧张素Ⅱ与基质金属蛋白酶及其抑制剂在糖尿病大鼠心肌中的表达及影响

　　作者：廖梅梅 熊世熙 肖然 宋陈芳 龚斐 陈森 作者单位：汉大学中南医院心内科，湖北 武汉 431700

　　【摘要】 目的 研究糖尿病(DM)大鼠心肌间质重构与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、转化生长因子(TGF)β1、基质金属蛋白酶(MMP)1及其抑制剂(TIMP1)的关系。方法 20只SD大鼠分为正常对照组(10只)，DM组(10只)，用STZ法建立DM模型，10 w时麻醉处死大鼠，免疫组化法检测Ⅰ和Ⅲ型胶原的表达，TGFβ1、MMP1和TIMP1蛋白的表达，RTPCR法检测TIMP1和MMP1 mRNA的表达。结果 DM组心脏指数和左心室指数显著高于正常组(P<0.05)，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达也增加，存在着心肌间质重构，同时AngⅡ，TGFβ1，TIMP1蛋白及TIMP1 mRNA表达增高，MMP1蛋白及mRNA表达减少(P<0.05)。结论 DM大鼠可能因肾素血管紧张素系统(RAS)的激活，AngⅡ表达增加，直接或间接的影响TGFβ1及MMPs的表达，导致心肌间质重构。

　　【关键词】 心肌间质重构 血管紧张素 基质金属蛋白酶

　　The expression of AngⅡ and metalloproteinases and its inhibitors in the myocardial of diabetic rats and their effect

　　LIAO MeiMei，XIONG ShiXi，XIAO Ran，et al.

　　Department of Cardiology，Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 431700，Hubei，China

　　【Abstract】 Objective To investigate the expression of AngⅡ，transforming growth factor (TGF)β1，matrix metalloproteinases (MMP)1 and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP)1 in diabetes mellitus (DM) rats and their relation to myocardial interstitial remodification.Methods 20 male SD rats were randomly divided into normal control group and DM group 〔induced by streptozotocin (STZ)〕,10 in each group.Ten weeks later，all rats were killed to measure expression levels of type Ⅰ，Ⅲ collagen，TGFβ1 protein，MMP1 and TIMP1 protein by immunohistochemistry method and detect the mRNA expressions of MMP1 and TIMP1 by RTPCR.Results The cardiac index and the left ventriclular index were significantly higher in DM group than those in normal group(P<0.05).The expression of AngⅡ，type Ⅰ，Ⅲ collagen，TGFβ1 protein，TIMP1 protein and mRNA were also significantly higher in DM group than those in normal group，while the expression of MMP1 protein and mRNA were significantly lower in DM group (P<0.05).Conclusions The activation of reninangiotensin system (RAS) in diabetic rat will increase the expression of AngⅡ，which may directly or indirectly effect the expression of TGFβ1 and MMPs ，all of this will result in the myocardial interstitial remodification of diabetic rat.

　　【Key words】 Myocardial interstitial remodification;AngiotensinⅡ;Matrix metalloproteinases

　　糖尿病(DM)心肌病是DM患者的严重并发症之一，与心力衰竭高发生率和死亡率密切相关。在链脲霉素(STZ)诱导的DM大鼠早期即可见心肌超微结构改变及心肌间质变化，其中心肌间质的变化主要表现为Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及比值的变化〔1〕，而基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMPs) 作为影响胶原含量的重要因素之一，在DM大鼠心肌中表达的研究很少。本研究通过对DM大鼠心肌中血管紧张素(Ang)Ⅱ与MMP1、TIMP1的表达及相互关系的研究，旨在进一步探讨肾素血管紧张素系统(RAS)、MMP1和TIMP1在DM大鼠心肌病变中的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物分组 雄性SD大鼠20只，体重 (251±12) g，3月龄，由武汉大学医学院实验动物中心提供，随机分为正常组10只，DM组10只.喂养1 w后，DM组禁食12 h，一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ) (1 mol/L枸橼酸钠缓冲液溶解，pH4.5)50 mg/kg。72 h后断尾测空腹血糖值，血糖持续3 d≥13.8 mmol/L(250 mg/dl)，动物进食、进水及尿量增加，说明DM大鼠造模成功。以后每2 w测随机血糖1次，监测血糖的变化。

　　1.1.2 主要试剂 STZ为美国Sigma公司产品，免疫组化抗体购自晶美生物技术公司，AngⅡ放射免疫分析试剂盒购自北京北方生物技术研究所，Trizol(Gibco)，cDNA合成试剂盒(TOYOBO)，TaqDNA聚合酶(TIANGEN)，dNTPmix(TOYOBO)均购自武汉凌飞公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本采集 DM大鼠建模未成功1只。DM组因感染死亡3只。造模成功10 w后，称取体重(BW)，测血糖，乙醚麻醉。解剖动物迅速取出心脏，称全心脏(HW) 和左心室(含室间隔，LVW)重量。以HW/BW为心脏指数(mg/g)，LVW/BW为左心室指数(mg/g)。将每只大鼠的左室心肌标本纵向分为两份，一份甲醛固定，制成蜡块;另一份-70℃低温冰箱保存。

　　1.2.2 AngⅡ含量的测定 取冷藏标本100 mg，采用AngⅡ放免试剂盒，按照说明测定AngⅡ的含量。

　　1.2.3 免疫组织化学染色 用于Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGFβ1和MMP1、TIMP1蛋白表达的检测。采用石蜡切片，切片厚4 μm，进行免疫组化染色，于显微镜下观察。每张切片随机选取5个视野，采用高清晰彩色图文报告分析系统，以5个光密度值(OD值)的平均值作为各标本的蛋白表达。

　　1.2.4 RTPCR法检测TIMP1、MMP1 mRNA的表达 取100 mg心肌组织采用Trizol一步法提取RNA，经紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。取15 μg总RNA逆转录成cDNA。 PCR按试剂说明书进行，以β肌动蛋白(βactin)为内参。引物由上海生物工程公司合成：MMP1引物 P1:gaatccagtctctctatggtccag，P2:cgtaaccctaatagtctttgtccata;TIMP1 引物P1：catggagagcctctgtggat，P2：gttcaggcttcagctttttgc;βactin引物P1：catgatggaggggccggactcact，P2：taaaeacctctattccaacacagt。MMP1循环条件:94℃变性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循环34次;βactin、TIMP1 循环条件:94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环34次。采用凝胶成像图像分析系统采集图像分析结果，将图像量化处理(面积×平均A 值/βactin 面积×平均A 值)后与内参照进行比对。

　　1.3 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行组间t检验。

　　2 结果

　　2.1 两组大鼠体重心脏指数，心室指数及胶原含量比较 见表1。DM组与正常对照组相比，实验结束时体重明显减轻(P<0.05)，而心脏指数(P<0.05)及心室指数(P<0.05)均增高，胶原Ⅰ、Ⅲ的表达也明显增高(P<0.05)，存在心肌间质重构。

　　2.2 两组大鼠AngⅡ含量、TGFβ1蛋白和MMP1、TIMP 1蛋白及mRNA表达比较 见表2。DM组与正常对照组相比，AngⅡ含量、TGFβ1蛋白表达、TIMP1蛋白表达及TIMP1 mRNA表达均增多(P<0.05)，MMP1蛋白表达及MMP1 mRNA表达均减少(P<0.05)。

　　表1 两组大鼠体重，心脏指数，心室指数及胶原含量比较(略)

　　与正常对照组比较：1)P<0.05;下表同

　　表2 两组大鼠AngⅡ含量、TGF β1蛋白和MMP1，TIMP 1蛋白及mRNA表达比较(略)

　　3 讨论

　　DM心肌间质重构主要表现为成纤维细胞(CFbs)过度增生，导致胶原(CL)合成增多，代谢加快〔2〕。目前研究认为RAS激活在DM心肌病的发生发展中起着很关键的作用，在DM早期心脏局部就有RAS激活，血管紧张素转换酶(ACE)活性升高，AngⅠ和Ⅱ含量及AngⅡ受体1(AT1)数目及亲合力增加。AngⅡ与AT1结合一方面通过诱导具有生长刺激性的原癌基因cfos、cjun、cmyc等和TGFβ1基因表达，刺激心肌细胞和微血管的异常生长，特别是胶原的合成;另一方面AngⅡ通过AT1衰减间质胶原酶的活性从而调节胶原的降解〔3〕，同时研究也表明AngⅡ可增加大鼠内皮细胞TIMP1的生成〔4〕。

　　TGFβ1是细胞外基质及纤维细胞的有效诱导剂，可刺激心脏成纤维细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达，还可下调胶原酶活性，减少胶原降解。DM时局部升高的AngⅡ通过增加PKC的表达可引起心肌细胞TGFβ1表达的增加〔5〕。活化的PKC增加丝裂原活性蛋白激酶(MAPK)的活性，MAPK磷酸化转录因子从而诱导cfos和cjun的转录。cfos和cjun 结合形成 AP1，它在启动子区域与一个特定的顺式作用元件即佛波醇酯反应元件(TRE)结合从而活化基因〔6〕。编码TGFβ1的基因包含于TRE 区域，故可间接上调TGFβ1表达。

　　MMPs作为胶原降解的主要酶系统，它们的表达及活性过度增强或MMPs/TIMPs比例失调与心肌纤维化有密切关系。MMPs的活性受多种因素的影响，AngⅡ既可直接在转录水平上调纤溶酶原激活物抑制剂(PAI1)基因表达，又可通过PKC途径上调TGFβ1的表达，诱导 PAI1 的产生，抑制MMPs的激活。而TGFβ1可直接在基因水平，通过与MMPs基因启动子区域所含有的TGFβ1抑制元件(TIE)结合下调MMP1的表达，促进TIMP1的转录〔7〕。MMPs的种类很多，根据底物的特异性和结构的不同可分为4类，MMP1属于胶原酶，主要水解底物是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原纤维;TIMP1强烈抑制除MMP2、膜型金属基质蛋白酶1(MT1MMP)外的多数MMPs。

　　本研究也证实伴随AngⅡ含量的憎多，TGFβ1表达增加，MMP1蛋白和基因表达均减少，TIMP 1蛋白和基因表达均增加，从而导致心肌胶原合成增多，降解减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原含量表达增加，心脏指数及心室指数均增加，形成心肌间质的重构，进一步还将影响DM大鼠的心功能，提示抑制RAS将有助于改善DM心肌病变。

　　【参考文献】

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