自发性高血压大鼠血管平滑肌CaN与心肌ATP酶活性变化

　　作者：刘艳明 作者单位：中国人民解放军251医院心内科，河北 张家口 075000

　　【摘要】 目的：研究自发性高血压大鼠不同血管平滑肌钙调神经磷酸酶(CaN)的活性与心肌ATP酶活性变化。方法：应用酶活性测定12周自发性高血压大鼠(SHR)和Wistar大鼠的胸主动脉(A)、肠系膜动脉(MA)、尾动脉(CA)血管平滑肌CaN及其心肌Na+-K+-ATPase的活性。结果：SHR大鼠不同血管CaN的活性与对照组相应的变化无显著差异，而其在CA中的活性明显低于在A的活性，在阻力血管MA中活性却无明显降低;Na+-K+-ATPase的活性与其对照组相应的变化有显著差异(P<0. 01) ;SHR大鼠血压和左心室肥厚指数增加(P<0. 05)。结论：SHR大鼠血压和左心室肥厚指数增加，SHR大鼠血压与其对照组相比不同血管平滑肌CaN的活性变化无显著差异，Na+-K+-ATPase的活性发生下降。

　　【关键词】 自发性高血压 CaN Na+-K+-ATPase 左心室肥厚。

　　Active Change of CaN in Artery Smooth

　　Muscle Cell and Na+K+ATPase in Myocardic with Spontaneous Hypertension

　　LIU Yanming1,WANG Xuefang2， MA Jianwei2, et al

　　1.No.251 Hospital of PLA,Zhangjiakou 075000 ，China;

　　2.Hebei North University, Zhangjiakou, 075000 ，China

　　【ABSTRACT】 Objective：To study the active change of Ca2+/CaM-Protein phosphatase(CaN) in different artery smooth muscle cell and the activity of Na+-K+-ATPase in myocardic with Spontaneous Hypertension.Methods: By the enzymologic measuring method we compared the change of the CaN and Na+-K+-ATPase from wister rats and SHR.Results: There are not significant differences between the SHR group and the wister group in the activities of CaN in different artery smooth muscle cell ,but the activities of CaN in CA decreased significantly,and the activities of CaN in MA didn’t change; the activities of Na+-K+-ATPase myocardia for SHR was decreased(P<0. 01) and LVH/BP for SHR were increased as well (P<0. 05).Conclusion: There are not significant differences between the SHR group and the wister group in the activity of CaN in different artery smooth muscle cell and Na+-K+-ATPase in myocardia with Spontaneous Hypertension were decreased and LVH/BP for SHR were increased.

　　【KEY WORDS】 Spontaneous Hypertension ;Calcineurin;Na+-K+-ATPase;left ventricular hypertrophy

　　原发性高血压又称高血压病,是目前病因尚未十分明确的以高血压和心肌肥厚为主要临床表现的一种疾病，其发生机制十分复杂，目前尚未阐明。近年来有研究发现原发性高血压与血管平滑肌CaN[1]、肌浆网Ca2+-ATPase及磷酸酶mRNA的活性有关[2]。另有研究表明[3、4]，心肌肥厚时心肌细胞膜的活性下降，从而使细胞内Na+浓度增加引起Na+-Ca2+交换加强，使细胞内Ca2+增加。为了进一步探讨血管平滑肌CaN与心肌ATP酶活性的变化在自发性高血压鼠上的表达，设计了本实验，旨在研究其在原发性高血压中的变化特点，探讨其生理意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物情况 SHR和Wister大鼠均购自北京中国医科院动物研究所，12周龄各组均10只，用RBP-1B型大鼠血压计(中日友好临床医学研究所生产)测量大鼠尾动脉血压。左心室肥厚指数用左心室湿重(LVW)与体重(BW)之比表示。右心室肥厚指数用右心室湿重(RVW)与体重(BW)之比表示。所用动物情况见表1。表1 动物基本情况注 * P<0. 05 vs Wister

　　1.2 药品 主要试剂乌苯苷购自华美生物工程北京分公司，ATP及其它试剂购自北京化学试剂商店。

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本制备 将大鼠击头致昏迅速取出心脏，胸主动脉(A)、肠系膜动脉(MA)、尾动脉(CA)。

　　1.3.2 CaN制备 参照Rajendra[5]方法，将大鼠击头致昏后，断头放血，迅速取出胸主动脉(A)、肠系膜动脉(MA)、尾动脉(CA)，将血管称重后立即置于液氮中速冻5min ，取出后剪碎，置于预冷(4℃)的匀浆缓冲液中(mmol/L)(Tris-HCl 50，pH 7. 5，EGTA 1，DDT 0. 5，PMSF 0. 5)，用DY89-1型电动玻璃匀浆机(宁波新芝科仪器研究所生产)，按7：1(体积：湿重)匀浆，匀浆液在4℃以14000转/min，离心30min，收集上清液，取少量测蛋白含量，其余作酶活性测定。

　　1.3.3 心肌细胞标本制备 参照文献[6]提取心肌细胞膜，将大鼠击头致昏迅速取出心脏，冷盐水冲洗，取100g心肌组织，加入预冷的匀浆缓冲液SEGT液(蔗糖 250mmol/L，EGTA 1mmol/L，pH 7. 2，Tris-HCl 50mmol/L)3ml匀浆，匀浆液在4℃以10000转/min离心20min，弃上清液，沉淀部分用1mlSEGT液悬浮，-70℃保存备用。

　　1.4 指标测定

　　1.4.1 CaN活性测定 反应液总体积1ml，反应液中含Tris-HCl 50mmol/L， PNPP 1mg/ml，MnCl2 0. 7 mmol/L，EDTA 0. 2 mmol/L，pH 7. 5，反应液在30℃水浴保温2min，加入0. 1ml酶启动反应，10min后加入0. 1ml 13% K2HPO4终止反应，用721分光度计在405nm比色，测定OD值。

　　1.4.2 Na+-K+-ATPase活性测定 按Jone[7]法略改进，反应液总体积1ml，内含Tris-HCl 50mmol/L，MgCl2 5. 0 mmol/L，NaCl 100mmol/L，KCl 15mmol/L，乌苯苷 2. 0mmol/L，ATP 4. 0mmol/L，36. 5℃温浴10min，加酶0. 1ml反应15min后，15%三氯醋酸终止反应，活性单位以每mg蛋白每小时释放无机磷的微克分子μ mol Pi/(mg pro. h-1)表示。

　　1.4.3 蛋白含量测定 采用Bradford法[8]，以牛血清蛋白为标准，用721型分光光度计测定OD值，根据标准曲线计算蛋白含量。

　　1.4.4 统计学处理 微机Excel统计软件，方差分析，经±s表示，以P<0. 05为显著差异。

　　2 结果

　　2.1 CaN活性 不同血管CaN活性变化(n=10) Wister鼠A、MA、CA的CaN活性分别为2. 85±0. 08，2. 53±0. 02，1. 73±0. 07。SHR鼠A、MA、CA的CaN活性分别为3. 01±0. 03，2. 42±0. 05，1. 75±0. 02。

　　2.2 心肌细胞膜Na+-K+-ATPase活性 Wister鼠为36. 31±0. 71，SHR鼠为15. 88±0. 31(见表2)。表2 SHR与Wister大鼠不同部位血管平滑肌CaN及心肌细胞膜Na+-K+-ATPase活性变化 注：* P<0. 05 vs A and MA， ** P<0. 01 vs Wister

　　3 讨论

　　原发性高血压占所有高血压病人的95%以上，但其病因尚未十分明确。其最主要临床表现是血压增高和左心室肥厚，从本实验所得到的动物的基本情况中也可以看到SHR与Wister相比其血压上升，左心室肥厚指数增加(P<0. 05)。心肌肥厚使心肌细胞膜的活性下降，从本实验中也可以观察到与Wister相比SHR心肌细胞膜上的 Na+-K+-ATPase活性下降(P<0. 01)。有研究表明[5]，细胞膜上的 Na+-K+-ATPase活性下降，使细胞内Na+浓度升高，Na+-K+交换障碍，从而引起Na+-Ca2+交换加强，使胞内Ca2+增加，是引起胞内高钙导致血压增高的重要因素之一。左心室肥厚是心脏对慢性压力或容量负荷增加的代偿性反应，也是指心肌细胞增大而无细胞分裂，是心肌细胞对于前和(或)后负荷增加的一种应答反应，它是心血管事件独立的危险因素。钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)是一种受Ca2+及钙调素(calmodulin, CaM)调节的多功能信号酶, CaN在全身组织广泛分布，在神经组织及淋巴组织中含量特别丰富，在骨骼肌、肺、脾、胰、肾及肝组织中均存在，尤其在心脏中有较高表达。 CaN不仅其本身可介导多条信号传导通路，而且通过去磷酸化作用可对其他信号传导通路进行调节，使Ca2+信号与其他第二信使的调节机制耦联起来，协同调节细胞的功能[6～8]。已知CaN依赖的信号通路在免疫细胞的活化中起到调节枢纽的作用, 但在非免疫细胞中的作用一直不甚清楚，其可以通过使活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell, NF-AT)转位入核, 调节核内一系列基因的表达。新近的研究表明[9、10], 原发性高血压所引起的心肌细胞肥大与细胞内高钙有关，胞浆中的高钙主要与肌浆网Ca2+-ATPase的活性和磷酸酶mRNA降低有关[11]，心肌细胞中存在的CaN信号通路, 它可能在介导Ca2+信号致心肌细胞肥大中起重要作用，提示其可能在心脏生理中存在重要作用。本实验结果表明SHR大鼠血压和左心室肥厚指数增加(P<0. 05);SHR大鼠不同血管CaN的活性与其对照组相应的变化无显著差异，而其在CA中的活性明显低于在A的活性，在阻力血管MA中活性却无明显降低;Na+-K+-ATPase的活性与其对照组相应的变化有显著差异(P<0. 01)。Na+-K+-ATPase活性在SHR身上明显下降与对照组之间有显著差异，是否与原发性高血压发病有关还有待于进一步研究。本文研究了SHR血管平滑肌CaN活性的变化特点及心肌ATP酶活性的变化特点，探讨了血管平滑肌CaN活性的变化特点及心肌ATP酶活性的变化特点与原发性高血压之间的联系，为今后进一步探索研究CaN及Na+-K+-ATPase与原发性高血压的关系及指导临床实践与治疗研究奠定了基础。

　　【参考文献】

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