人单核源性泡沫细胞疾病模型的建立

　　作者：吴鹏 刘映峰 梁东辉 陈允钦 缪绯 刘永源 作者单位：南方医科大学附属珠江医院心血管内科，广东 广州 510282

　　【摘要】 目的 建立人单核源性泡沫细胞的疾病模型，为动脉粥样硬化(AS)的发生发展机制及其防治研究提供新途径。方法 采用密度梯度离心法分离冠心病患者外周血单核细胞，以80 nmol/L佛波酯(PMA)诱导48 h使之转化为巨噬细胞，然后与80 mg/L氧化低密度脂蛋白(oxLDL)共孵育48 h，使之转化为泡沫细胞。结果 经PMA诱导后，光镜下观察发现单核细胞已转化为形态典型的巨噬细胞。与oxLDL共孵育48 h后，油红O染色和透射电镜观察发现细胞内出现了大量的红染颗粒或脂质空泡。高效液相色谱检测发现细胞内胆固醇(TC)明显增加，其中胆固醇酯(CE)含量大于TC的60%，符合泡沫细胞的定义。结论 从离体细胞培养方面探寻并建立了人单核源性泡沫细胞的疾病模型，该模型的病生特性与人类AS疾病接近，具有制备方法简易、细胞材料来源广等优点。

　　【关键词】 单核细胞;巨噬细胞;泡沫细胞;动脉粥样硬化;模型

　　Establishment of a human monocytederived foam cell disease model

　　WU Peng，LIU YingFeng，LIANG DongHui,et al.

　　Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510282，Guangdong，China

　　【Abstract】 Objective To establish a human monocytederived foam cell model，so as to offer a novel method for studying the pathogenesis and progression mechanisms as well as the prevention and treatment of atherosclerosis (AS).Methods Monocytes were isolated from peripheral blood of coronary heart disease (CHD) cases by FicollHypaque density gradient centrifugation.The isolated cells were induced by phorbol 12myristate 13acetate (PMA) at 80 nmol/L for 48 h and coincubated with oxLDL at 80 mg/L for another 48 h.Results Macrophages in typical morphologies were successfully transferred from monocytes induced by PMA.When incubated with 80 mg/L oxLDL，the ratio of cellular cholesteryl ester to total cholesterol in macrophages was beyond 60% identified by HPLC analysis，and there were also many lipid droplets displayed in cells both under transmission electron and light microscopes，which indicating the formation of foam cells.Conclusions A foam cell model is successfully established in vitro from monocytes of CHD cases.The physiopathologic characteristics of the model are some more similar to that of human AS diseases than other models，further more，the derived cells are easily obtained and the model is easily made.

　　【Key words】 Monocytes;Macrophages;Foam cells;Atherosclerosis;Model

　　泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化(AS)过程中最主要的细胞学改变。在致病因素的作用下，增生的单核巨噬细胞及血管平滑肌细胞表面受体的表达发生改变，在内皮下无反馈地吞噬大量化学修饰的低密度脂蛋白(LDL)，主要是氧化LDL(oxLDL)，使细胞内胆固醇(TC)代谢失衡，胆固醇酯(CE)合成增加，分解减少，以脂滴的形式大量聚集在细胞内。泡沫细胞形成和死亡过程中所释放出TC，是AS主要成分〔1，2〕。因此，本文旨在建立体外人单核源性泡沫细胞疾病模型，为研究AS提供真实、可靠的模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器

　　淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物科技公司);佛波酯(phorbol 12myristate 13acetate，PMA，Sigma公司);Bradford 蛋白质定量测定试剂盒(上海申能博彩生物科技公司);丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);超速离心机(OptionTM L80 XP，Beckman，USA);高效液相色谱仪(美国惠普公司);ELX 800酶标仪(BIOTEK公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 oxLDL的制备

　　血清LDL的制备方法参考文献进行改进〔3〕。根据天然LDL(nLDL)的密度(d=1.006～1.063 g/ml)，采用一次性超速密度梯度离心法从血清中分离LDL。LDL在4℃、含0.01% EDTA的PBS中透析48 h，经琼脂糖电泳显示为单一蛋白条带。将nLDL置于4℃ PBS溶液中透析24 h，去除EDTA、溴化钾(KBr)等杂质后，37℃下于含10 μmol/L CuSO4的PBS溶液(pH 7.2)中透析12 h，进行氧化修饰。oxLDL置于含0.01% EDTA的PBS中，4℃透析24 h，终止氧化。超滤除菌，Bradford法测定蛋白含量，调整浓度至1 g/L用于实验。通过测定硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)的量来确定LDL的氧化程度，即每mg LDL蛋白中MDA的含量。按说明书操作，测得新鲜LDL、oxLDL的MDA分别为2.30及21.20 μmol/g。

　　1.2.2 人单核细胞的制备

　　对常规分离单核细胞的密度梯度分离法〔4〕稍作改进。取冠心病患者空腹静脉血，肝素抗凝后置于离心管中，2 000 r/min，离心20 min，弃上层血浆，保留下层细胞成分。于细胞中加入一定体积的Hank液，混匀制成细胞悬液，然后小心而缓慢地将其加于等体积的淋巴细胞分离液上面，4℃、2 000 r/min离心20 min。取出离心管，可见管中液体已经分层。单个核细胞居中，呈乳白色。吸取所需细胞，用PBS离心洗涤2次，再以RPMI1640培养基离心洗涤1次。加入一定体积的完全培养液重新混悬细胞，在37℃、5%CO2孵箱中培养2～3 h，去上清，即得贴壁的单核细胞。进行细胞计数，按需调定细胞密度。取一定体积的上述细胞，采用流式细胞仪测定细胞表面的CD14、CD56，结果提示单核细胞的纯度达98%，台盼蓝拒染法测定各组细胞存活率达99%。将细胞置于37℃含5%CO2和95%空气的孵箱中培养备用。

　　1.2.3 单核细胞转化为巨噬细胞

　　待上述细胞静止12 h后，换入含80 nmol/L PMA的RPMI1640完全培养基，刺激48 h使之转化为巨噬细胞〔5〕，换入无血清培养液待处理。

　　1.2.4 实验分组

　　细胞分为对照组和oxLDL组，对照组只加培养基，oxLDL组另加oxLDL至终浓度为80 mg/L，培养48 h后收集细胞，检测相关指标。

　　1.2.5 巨噬细胞油红O染色

　　按覃丽等〔6〕方法，将细胞培养于预先放有无菌盖玻片的12孔培养板，处理结束后，用PBS冲洗盖玻片3次，每次5 min，50%异丙醇固定1 min，油红O染色液染色10 min，蒸馏水冲洗3次，每次1 min，苏木素染色5 min，分色和返蓝后，倒置显微镜下观察细胞内脂质染色情况。

　　1.2.6 巨噬细胞透射电镜观察

　　以1∶1(V/V)的比例在每瓶培养细胞中加入2%戊二醛预固定30 min，低速离心30 min，去上清后制备细胞团，以每份细胞团与5份2%戊二醛的比例固定细胞，标本送南方医科大学电镜室行透射电镜观察。细胞内脂质在透射电镜下表现为胞浆内或大或小的脂质空泡。

　　1.2.7 高效液相色谱分析细胞内胆固醇的变化

　　收集细胞后，冰浴中超声破碎细胞。采用Bradford法测定细胞内蛋白质含量。将细胞溶解产物等量分为两份，一份加入等体积新鲜配制的15% KOH醇溶液，室温涡旋至细胞溶解产物清亮，用以获取TC;另一份加入等体积新鲜配制的8.9 mmol/L的KOH醇溶液，置于80℃水浴中1 h，用以获得游离胆固醇(FC)。分别加入6%的三氯乙酸去蛋白。再加入等体积的正己烷∶异丙醇4∶1溶液(V/V)，将混合物涡旋5 min，然后以1 500 r/min离心5 min，收集上层有机相。将下层水相按上述方法重复抽提两次。将混合的有机相在真空冷冻干燥机中65℃干燥，室温冷却后，加入100 μl异丙醇∶正庚烷∶乙腈35∶12∶52 (V/V)将样本溶解，活性碳去色素，超声除气5 min，1 500 r/min离心5 min，收集上清液，取10 μl进样，进行高效液相色谱分析。按峰面积外标法定量，以TCFC= CE计算细胞内CE/TC的比值。

　　1.3 统计学处理

　　数据均采用x±s表示，采用SPSS 11.0软件进行两组间双侧t检验。

　　2 结 果

　　2.1 单核细胞的形态学改变

　　单核细胞经80 nmol/L的PMA诱导48 h后，25×10倍光学显微镜下观察，大部分细胞已由圆形变成多角形状，并易于聚集，贴壁，说明细胞已由单核细胞转化为巨噬细胞(图1)。

　　2.2 泡沫化细胞的形成

　　分化成巨噬细胞的单核细胞与80 mg/L的oxLDL共孵育48 h，油红O染色后光镜下可见细胞内有大量的红色脂质颗粒存在，且个别细胞由于吞噬的脂滴过多而使体积增大，符合泡沫细胞的形态学特征，而不加oxLDL的对照组细胞内无明显的红色油滴状颗粒(图2)。同样，在透射电镜下，对照组细胞浆内无脂质空泡，而oxLDL组细胞胞浆内出现大量的脂质空泡(图3)。以上结果表明oxLDL处理的细胞胞浆内有大量的脂质堆积。

　　2.3 细胞内TC和CE的含量

　　细胞内TC和CE在高效液相色谱图上均表现为独立的吸收峰，第一个峰为TC的吸收峰，第二个峰为CE的吸收峰。进一步定量分析发现，对照组细胞内CE只占TC的35.21%左右，而oxLDL组细胞内CE明显增加，占细胞内TC的60%以上(表1)，符合泡沫细胞的生物学定义〔7〕。表1 细胞内胆固醇和胆固醇酯的含量(mg/g细胞蛋白)(略)

　　3 讨 论

　　疾病研究模型通常分为整体、器官与细胞3个水平，与AS动物模型相比，细胞疾病模型是研究AS发病机制及防治途径的更为精细的工具。目前通过体外培养方法建立泡沫细胞模型，可使用的细胞株较多，杨永宗〔8〕等曾用小鼠腹腔巨噬细胞复制泡沫细胞模型，刘国庆〔9〕等用转染激素敏感基因的中国仓鼠卵巢细胞制成泡沫细胞，此外，人纤维母细胞、人HepG2肝细胞、J744巨噬细胞〔10〕、猪主动脉平滑肌细胞〔11〕、家鸽巨噬细胞〔12〕等细胞株也被广泛用于泡沫细胞模型建立。但这些细胞模型无论是实验动物或是所用细胞，其病理生理特性都与人类AS疾病的泡沫细胞相去甚远。本实验采用CHD患者外周血单核细胞为材料，制备出人单核源性泡沫细胞的疾病模型。该模型具有以下优点：①实验细胞取材于被证实是人类AS斑块中泡沫细胞来源的人外周血单核细胞，其病理生理特性较其他细胞株更为贴近于人体。②实验细胞取自CHD患者，其病理生理特性与AS疾病状态接近。③曾有人用人单核源性巨噬细胞与100 mg/L乙酰化LDL共孵育48 h后制备出泡沫细胞的疾病模型〔13〕，与本模型所用oxLDL剂量和时间相近，但本模型所使用的是已证实在AS斑块内存在的oxLDL，从而避免了个体差异，同时从人体取材进行原代细胞培养也较为方便、快捷，可在5～7 d范围内完成1个周期的实验。④人单核细胞上同时存在经典的A类清道夫受体(SRA)和B类清道夫受体(SRB)，故本模型有利于SRA和SRB结构、功能等特性的研究。⑤oxLDL可诱导单核细胞的分化和黏附，但oxLDL的促分化作用没有PMA作用强〔5〕，形成泡沫细胞的作用相对较弱。PMA可使细胞表面SRA和SRB受体的表达明显增加，故本实验以PMA诱导单核细胞分化成巨噬细胞，再予相应的处理，避免或降低了实验细胞分化程度的不均一性。然而，细胞来源于AS疾病患者抑或健康个体在模型建立中有无差异，有待探讨。

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