大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的改良及实验观察

　　作者：杨简 杨俊 丁家望 李松 席祖洋 李稳慧 作者单位：三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院心内科，湖北 宜昌 443003

　　【摘要】 目的 改良大鼠在体心肌缺血/再灌注(I/R)损伤模型，探讨I/R对大鼠心肌的影响。方法 45只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血组和I/R组，对传统造模方法进行改进，建立MI/RI模型。记录手术过程心电图改变;术后左心室心肌TTC染色，分析心肌梗死面积;所有心肌标本均HE染色行组织学检查。结果 缺血组及IR组结扎左冠状动脉前降支后心电图ST段显著抬高(≥0.1 mV)，IR组恢复血液灌注后ST段回落并可伴有各种心律失常表现，Sham组手术前后无变化;IR组心肌梗死面积高于Sham组(P<0.01)及缺血组(P<0.05);IR组病理改变明显，成功改进了心肌MI/RI动物模型。结论 制备大鼠MI/RI模型简便易行，结果稳定，为研究I/R机制提供了理想的造模方式。

　　【关键词】 心肌;缺血再灌注;模型;大鼠

　　大鼠的冠状动脉侧支循环少、重复性好，已被公认为制作心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)模型的首选实验动物模型〔1〕。传统的模型制备操作复杂、耗时长、死亡率高。为寻求更为理想的MI/RI实验模型的制备方式，我们进行了长期摸索，参照不同研究人员采用的模型制备方法〔2～4〕，并结合本实验室条件，应用拉线压管法对该模型制作加以改进，来观察缺血再灌注(IR)对大鼠心肌的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠45只，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供(许可证号：SCXK〔鄂〕20040007)，体重220～250 g，实验动物级别：SPF。

　　1.2 主要仪器与试剂 ECG9130P 12导心电图机(日本光电);DW2000型动物人工呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司);氯化三苯四氮唑(tetrazolium，TTC)购自美国Sigma公司;其余试剂均为国产市售分析纯。

　　1.3 动物模型的改进及分组 参照文献〔2～4〕方法加以改进。取SD大鼠，以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定于鼠板。气管切开后动物呼吸机机械通气。辅助呼吸参数为:呼吸频率50次/min，潮气量20 ml/kg，呼吸时比1∶1〔5〕。大头针穿刺四肢皮下接心电图机，稳定5 min后记录一段正常心电图(纸速：100 mm/s，电压：20 mm/mV)作为对照。胸骨左侧2 mm切开皮肤，在第四肋间隙用眼科剪向下分离肋间肌，向上伸入血管钳夹闭两侧肋间肌以减少出血。剪断3、4肋骨，用拉钩拉开胸壁，在两侧胸壁肌肉分别穿一双线留小圈在内侧。小心剪开心包膜，暴露心脏，用棉签轻压住心脏。以左冠状静脉主干为标志，在左心耳下缘3～4 mm处，以50无创缝合针进针，进针约1.5 mm，斜向右上方肺动脉圆锥方向出针，针距3～4 mm，并置一内径1.5 mm、长0.5 cm的带凹槽乳胶管备用，分别将线两端穿入小圈内。待呼吸平稳10 min后收紧结扎线，连同乳胶管一并结扎，使乳胶管压迫左冠状动脉前降支(LAD)。整个实验过程同步记录手术前后多导联心电图，冠状动脉结扎30 min后轻拉松结扎线，恢复血液灌注。将大鼠随机分成3组：假手术组(Sham组，n=15)，仅穿线，不结扎LAD;缺血组(n=15)，单纯结扎LAD 30 min;缺血再灌注组(IR组，n=15)，结扎LAD 30 min，再灌注120 min。

　　1.4 模型评估 三组实验动物分别记录手术过程的心电图改变。术后取出大鼠心脏，用冰生理盐水冲洗，除去血渍后用保鲜膜包裹置于-20℃冷藏10 min，切除主动脉、大血管和右心室，将左室沿心脏纵轴均匀切成5层，各2 mm，置避光37℃ 2% TTC溶液内30 min，取出数码照相，利用ImagePro Plus5.0专业图像分析软件计算心肌梗死面积〔6〕。所有心肌标本HE染色，在≤400倍光镜下观察其组织形态学改变。

　　1.5 统计学分析 采用SPSS10.0软件包，计量资料以x±s表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较用q检验。

　　2 结果

　　2.1 模型制备情况 所有大鼠无意外死亡。用改进的方法制备大鼠MI/RI模型45只，成功45只，成功率100%。

　　2.2 心电图检查结果 缺血组及IR组在结扎心肌左冠状动脉前降支后心电图QRS波增高、增宽或ST段显著抬高(≥0.1 mV)。IR组大鼠增高的ST段在恢复血液灌注早期快速回落，再通15 min内回落50%，此后缓慢降低。另外，再灌注期间，随ST段下移可伴有室性早搏、室性心动过速等心律失常表现。Sham组手术前后心电图无明显改变。

　　2.3 缺血再灌注对心肌梗死面积的影响 Sham组大鼠心肌TTC染色后，未见明显心肌梗死;缺血组及IR组大鼠心肌梗死面积分别为22.5±4.0和27.1±3.6，明显高于Sham组(1.2±0.4)(P<0.01);IR组心肌梗死面积略高于缺血组，差异仍有统计学意义(P<0.05)。

　　2.4 病理形态学检查 Sham组心肌细胞排列整齐、无变性、间质无水肿、出血。缺血组可见心肌细胞肿胀，肌浆呈嗜伊红染色，横纹模糊不清或消失，肌纤维及肌丝轻度紊乱。IR组缺血心肌虽然恢复血供，但灌注早期的120 min内其组织病理学改变未见明显改善，缺血后再灌注中心区的心肌纤维素紊乱，局部呈波纹状改变，部分肌纤维溶解液化，心肌间质可出现少许红细胞，见图1。

　　图1 各组大鼠心肌组织光镜下改变(HE，×400)(略)

　　3 讨论

　　开展MI/RI研究是心血管领域中的重大课题。LAD是左心供血的最主要血管。在本实验中，我们采用拉线压管法结扎大鼠LAD造成心肌缺血，30 min后松线行再灌注，对传统动物模型进行简单改良后收到了良好效果。

　　目前大鼠MI/RI模型有两种：心脏原位结扎法和胸腔外结扎法。前者的优点是心脏处于正常解剖位置，对心脏生理功能影响较小，其缺点是视野小操作困难。胸腔外结扎，将心脏挤压至胸腔外，操作可视性强，但人为因素严重地影响心脏的电生理和泵功能，多次牵挤心脏常常会导致大鼠死亡。我们对模型制备方法加以改进后，实验观察证明，具有以下优点：①拉钩法暴露心脏，避免了使用扩胸器带来的操作不便，使得操作容易、暴露充分及损伤更小。②通过拉紧丝线使乳胶管压迫LAD造成心肌缺血，未改变心脏的正常解剖位置，能明显减少对心肌的外界刺激，较大程度地提高造模的成功率(本实验无1例手术失败)。③实验结果受术者外科技术和熟练程度影响较小，且手术时间短，血管再通率高。④恢复心肌血液灌注时，仅需拉松结扎线，从而避免了使用剪刀、血管钳等器械对心肌的机械性损伤，使得实验数据更为可靠。

　　该方法成败的关键包括两方面：呼吸的维持和心电图监测。动物呼吸机使用过程中，应严格调整相关参数以及关胸前挤出胸腔内残余气体，防止肺脏萎缩，使大鼠在缺血过程中能够保持呼吸通畅。实验过程中，心电图监测也非常重要。冠脉结扎后QRS波高大改变的原因可能为：QRS相量发生改变导致QRS波极性及形态改变，ST段亦抬高形成单相曲线。由于大鼠心率快，心电图记录时需加快走纸速度至100 mm/s。心电图单纯的ST段抬高不能作为冠脉阻断的肯定指标〔7〕，结扎冠脉时不可避免针、线对心肌的刺伤、牵拉等损伤，心肌机械损伤也可引起ST段弓背抬高。

　　本实验结果显示，当LAD结扎2～5 min左右，QRS波高大增宽或ST段显著抬高，恢复血液灌注数分钟后，QRS波回落变窄，ST段逐渐下移并常伴有相对短暂的再灌注心律失常，以室性早搏、短阵室速为多见;IR组心肌梗死面积高于Sham组、缺血组;上述改变与心肌组织的病理变化趋势基本一致。说明我们改进后的动物模型可以较好地反映IR对大鼠心肌的影响。因此，该方法的创立为进一步对MI/RI机制的研究开辟了广阔的前景。

　　【参考文献】

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　　3 刘付平，姚宏伟,李 俊.大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的改进〔J〕.安徽医科大学学报，2003;38(3):2346.

　　4 齐志敏，王 倩，张 莹.大鼠心肌缺血再灌注损伤实验模型研究〔J〕.中国临床康复，2004;8(30):66201.

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　　7 王砚青，江时森，刘 平，等.大鼠心肌缺血再灌模型心电图变化分析〔J〕.医学研究生学报，2006;19(8):7002.