睾酮对血管内皮细胞衰老的干预作用

　　作者：彭慧茹 吴赛珠 阮云军 陈国栋 赖文岩 作者单位：南方医科大学附属南方医院心血管内科，广东 广州 510515

　　【摘要】 目的 观察睾酮对过氧化氢(H2O2)诱导衰老的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的影响，初步探讨其作用机制。方法 分别用MTT还原法和SAβgal细胞化学检测法观察不同浓度睾酮及雄激素受体拮抗剂Flutimide、雌激素受体拮抗剂ICI182,780对HUVECs衰老的干预作用。结果 睾酮在3.0×10-9、3.0×10-8和3.0×10-7 mol/L 3种浓度下均具有延缓H2O2诱导的HUVECs的细胞增殖率降低和SAβgal阳性率明显增加的趋势。与3.0×10-8 mol/L睾酮干预组相比，予1.0×10-6 mol/L ICI182，780预处理， HUVECs的细胞增殖率明显降低，SAβgal阳性率明显增加。结论 睾酮对H2O2诱导的HUVECs衰老的影响与其剂量有关，生理浓度睾酮对其具有一定的延缓作用，而且这种生物学效应是部分通过转化为雌激素后，作用于雌激素受体实现的。

　　【关键词】 睾酮;内皮细胞;衰老

　　基金项目：国家“973”项目子课题(No.2007CB507400)

　　Effects of testosterone on the senescence of vascular endothelial cells

　　PENG HuiRu ,WU SaiZhu, RUAN YunJun, et al.

　　Cardiovascular Department, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of testostrone on the senescence of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) induced by hydrogen peroxid (H2O2). Methods Effects of testosterone at different concentrations with or without its antagonist Flutamide or estrogen receptors antagonist ICI182,780 on the senescence of HUVECs induced by H2O2 were studied by means of MTT method and SAβ galactosidase staining. Results H2O2(60 μmol/L,72 h)depressed proliferation and induced senescence of HUVECs(43.05±0.16 for MTT method, 57.10±1.03 for SAβ galactosidase staining method, P<0.01 vs control) .Testosterone at low concentrations(3×10-9,3×10-8and 3×10-7 mol/L) had the trend of delaying depression of proliferation and senescence of HUVECs induced by H2O2, most obviously at concentration of 3×10-8 mol/L(but P>0.05 vs H2O2 stimulated group), whereas higher concentration(3×10-6 mol/L) had stimulated effect on the senescence induced by H2O2(36.88±0.38 for MTT method, P<0.05 vs H2O2 stimulated group; 70.20±3.40 for SAβ galactosidase staining method, P<0.01 vs H2O2 stimulated group).The estrogen receptors antagonist ICI182,170 rather than androgen antagonist Flutamide at concentration of 1×10-6mol/L inhibited the delay effect induced by testosterone at concentration of 3×10-8 mol/L. Conclusions Testosterone modulates the senescence of HUVECs induced by H2O2 in a doserelated manner. And at physiological concentrations, testosterone has the trend of delaying it, mainly by transforming to estrogen acting on estrogen receptors.

　　【Key words】 Testosterone; Endothelial cells; Aging

　　血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化(AS)的始动因素，而衰老的血管内皮细胞会发生形态和功能的改变，对血管的病理生理产生重要影响〔1〕。研究表明，男性40或50岁后体内睾酮水平明显下降，游离睾酮和生物活性睾酮水平降低更为显著，与此同时性激素靶器官的功能随之发生显著变化〔2〕。但睾酮对血管内皮细胞衰老的影响及其可能机制如何目前尚无报道。本实验主要探讨睾酮对H2O2诱导的血管内皮细胞衰老的干预作用,并初步探讨其作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 药物配制 睾酮、Flutamide、ICI182,780(Sigma公司)。精确称取以上药物在无水乙醇中搅拌溶解, 睾酮配制成3×10-2 mol/L 浓度，其他药物均配制成1×10-2 mol/ L，抽滤除菌。临用前用培养基将睾酮依次稀释为3×10-6、3×10-7、3×10-8和3×10-9 mol/L (各药物中乙醇终浓度均小于0.1%)，Flutamide、ICI182,780均稀释为1×10-6 mol/L。

　　1.2 细胞培养 人二代脐静脉内皮细胞(HUVECs) 及其低血清培养基购自美国Cascade Biologics 公司。细胞复苏后予10%胎牛血清的培养基，于37℃、5%CO2培养箱中静置培养，所用细胞为3～5代。

　　1.3 实验分组与处理 ①正常对照组：予低血清(2%)培养基; ②H2O2刺激组：予低血清(2%)培养基+ H2O2 (60 μmol/L); ③各浓度睾酮干预组: 分别予睾酮3.0×10-9、3.0×10-8、3.0×10-7和3.0×10-6 mol/L培养30 min后，再予H2O2(60 μmol/L);④机制研究组:分别予ICI182, 780、Flunimate 1×10-6 mol/L 培养30 min后，给予睾酮(3.0×10-8 mol/L)，30 min后再予H2O2(60 μmol/L)。

　　1.4 MTT法观察睾酮及性激素受体拮抗剂对细胞增殖的影响 本法先用于观察H2O2对内皮细胞增殖率的影响，预实验得到的最佳刺激浓度和时间(H2O2 60 μmol/L，72 h)，再用于观察药物对细胞增殖的影响。细胞接种于96孔培养板中，按以上分组干预72 h后，终止培养前每孔加入MTT溶液(最终浓度为1 mg/ml)，37℃培养4 h。弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，微振荡，用酶标仪在492 nm下测定各孔光吸收值。以实验组与空白对照组光吸收值百分比代表细胞增殖的百分数，以上实验重复5次。

　　1.5 SAβgal染色法观察睾酮及性激素受体拮抗剂对细胞衰老的影响 将细胞接种于6孔板中培养，当细胞融合达80%时，换用无血清培养基静止24 h,按上述分组进行干预。72 h后，漂洗、固定，每孔加入1 ml X半乳糖苷酶(Xgal)染液，染液含20 mmol/L Xgal、40 mmol/L醋酸磷酸钠(pH6.0)、5 mmol/L铁氰化钾、5 mmol/L亚铁氰化钾、150 mmol/L氯化钠、2 mmol/L氯化镁(按照试剂盒说明书操作，碧云天公司)。37℃孵育4 h。在显微镜下观察并计数蓝染的细胞为阳性细胞，每次随机挑选200个细胞，得到阳性细胞百分率，即为衰老细胞的百分率，以上实验重复5次。

　　1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，数据以x±s表示，组间比较进行单向方差分析和LSD多重比较。

　　2 结果

　　2.1 各种浓度睾酮及性激素受体拮抗剂对H2O2诱导衰老的HUVECs增殖率的影响 H2O2刺激组HUVECs增殖率为(43.05±0.16)%，说明H2O2可以降低HUVECs增殖率。生理浓度(3.0×10-8 mol/L)睾酮与稍高于或低于生理浓度(3.0×10-7、3.0×10-9 mol/L)的睾酮都具有增加H2O2诱导的HUVECs的增殖率的趋势，其细胞增殖率分别为(49.04±1.57)%，(46.74±1.54)%，(45.10±1.58)%，而且生理浓度的睾酮效果最明显，但与H2O2刺激组比较均无显著差异(P=0.324,P=0.800,P=0.998)。高于生理浓度(3.0×10-6 mol/L)的睾酮具有进一步降低H2O2诱导的HUVECs的增殖率的作用，其细胞增殖率为(36.88±0.38)%，与H2O2刺激组比较差异显著(P<0.01)。与生理浓度(3.0×10-8 mol/L)睾酮组相比，先给予雌激素受体拮抗剂孵育，可以拮抗生理浓度睾酮的干预作用，降低H2O2诱导的HUVECs的增殖率，其细胞增殖率为(38.16±0.50)% (与H2O2刺激组比较P<0.01，与生理浓度睾酮组比较P=0.029);而先给予雄激素受体拮抗剂，却可以增加H2O2诱导的HUVECs的增殖率其细胞增殖率为(58.38±1.07)% (与H2O2刺激组比较P<0.01，与生理浓度睾酮组比较P=0.035)。

　　2.2 各种浓度睾酮及性激素受体拮抗剂对H2O2诱导的HUVECs衰老的影响 与空白对照组〔(2.90±0.43)%〕相比，H2O2可以引起SAβgal阳性细胞明显增加, 阳性率为(57.10±1.03)%(P<0.01)。与H2O2刺激组相比，生理浓度(3.0×10-8 mol/L)的睾酮与稍高于或低于生理浓度(3.0×10-7 mol/L、3.0×10-9 mol/L)的睾酮都具有减少SAβgal阳性细胞率的趋势，其阳性率分别为(50.80±3.36)%，(51.20±2.60)%和(54.40±1.20)%，而且生理浓度的睾酮效果最明显，但统计学差异均不显著(P=0.094, P=0.115, P=0.464);高于生理浓度(3.0×10-6 mol/L)的睾酮却可以增加SAβgal阳性细胞率，阳性率为(70.20±3.40)%(P<0.01)。与生理浓度(3.0×10-8 mol/L)睾酮干预组相比，先给予雌激素受体拮抗剂孵育，可以拮抗生理浓度睾酮的干预作用，增加SAβgal阳性细胞率，阳性率为(67.00±2.82)%(与H2O2刺激组比较P<0.05，与生理浓度睾酮比较P<0.01);而先给予雄激素受体拮抗剂孵育，可以减少SAβgal阳性细胞率，阳性率为(42.90±3.62)%(与H2O2刺激组比较P<0.01，与生理浓度睾酮比较P=0.038)。

　　3 讨论

　　目前公认的衰老标志物主要有SAβgal活性和细胞的增殖能力。本研究通过SAβgal染色和MTT法检测细胞增殖活性，结果显示，与空白对照组比较，H2O2刺激组大部分HUVECs表现出SAβgal染色阳性和增殖能力明显降低的变化，证明本研究所设计的衰老细胞模型是可靠的。

　　睾酮水平随年龄变化个体差异较大，正常成年男性的早晨血浆睾酮水平为11～35 nmol/L。出生后随年龄逐渐升高, 25岁时达高峰, 此后随年龄下降，至75岁时，平均总血浆睾酮水平为峰值的2/3,平均游离睾酮和生理活性睾酮血浆水平只是峰值的1/2〔3〕。Ling〔4〕等发现睾酮(1～100 nmol/L)可以明显减少血清剥离24 h后的HUVEC系EA.hy926的DNA合成，且这种影响呈剂量依赖关系，而雄激素受体拮抗剂 Flutamide (100 nmol/L) 可以阻断睾酮(10 nmol/L)的这种作用。血清剥离48 h后，EA.hy926的DNA呈现出明显的凋亡状态，睾酮可以加剧这种损伤。而金红〔5〕等用MTT法检测睾酮对原代HUVECs生长的影响，发现与对照组相比，3×10-10～3×10-8 mol/L 3种浓度睾酮对细胞生长无明显影响，而3×10-6、3×10-5 mol/L睾酮组从第3天起细胞生长受到抑制。而上述研究不同的原因推测可能与不同的作用条件与细胞有关。本研究发现，与H2O2刺激组相比，生理浓度(3.0×10-8 mol/L)和稍高于或低于(3.0×10-7、3.0×10-9 mol/L)生理浓度的睾酮都具有延缓H2O2引起的HUVECs的增殖率降低和SAβgal染色阳性率增加的趋势，生理浓度睾酮效果最明显。高浓度睾酮(3.0×10-6 mol/L)可加速H2O2诱导的HUVECs的衰老和凋亡。

　　睾酮对血管壁的作用非常复杂，其对血管壁细胞的分子作用机制还没有完全明确。目前资料显示它可以进入细胞，结合并激活雄激素受体;也可以穿过细胞膜，芳香化为雌激素，结合并激活雌激素受体α和β，产生其生物学效应〔6〕。本研究发现，予雌激素受体拮抗剂ICI182,780可以促进H2O2诱导HUVECs衰老的作用，消除生理浓度睾酮对其延缓衰老的趋势，与H2O2刺激组或生理浓度睾酮干预组比较，都表现为细胞增殖能力降低，SAβgal染色阳性细胞比例增多;而予雄激素受体拮抗剂预孵育，却产生相反的作用。由此推断，生理浓度的睾酮对H2O2引起的HUVECs衰老的延缓趋势，或许是通过芳香化转化为雌二醇后，作用于雌激素受体产生。总之，血管老化对增龄相关的心血管疾病有着重要的影响。进一步探讨雄激素及性激素受体在衰老相关信号传导中的作用，将有利于深入了解雄激素在调节血管老化中的重要作用，为增龄相关的脉管系统的疾病的防治提供新的思路。

　　【参考文献】

　　1 Minamino T, Komuro I. Vascular cell senescence contribution to atherosclerosis〔J〕.Circ Res, 2007;100(1):1526.

　　2 Feldman HA, Longcope C, Derby CA, et al. Age trends in the level of serum testosterone and other hormones in middleaged men: longitudinal results from the Massachusetts Male Aging Study〔J〕. J Clin Endocrinol Metab， 2002; 87:58998.

　　3 Harman SM, Metter EJ, Tobin JD, et al. Longitudinal effects of aging on serum total and free testosterone levels in healthy men〔J〕. J Clin Endocrinol Metab，2001;86:72431.

　　4 Ling SH, Dai AZ, Williams MR, et al. Testosterone enhances apoptosisrelated damage in human vascular endothelial cells〔J〕.Endocrinology，2002;143(3):111925.

　　5 金 红，富 路，梅轶芳，等. 睾酮对人血管内皮细胞产生NO、tPA和PAI1的影响〔J〕. 中国应用生理学杂志，2004;20(4)：33841.

　　6 Liu PY, Death AK, Handelsman DJ. Androgen and cardiovascular disease〔J〕. Endocr Rev， 2003;24(3):31340.