高危或极高危原发性高血压患者外周血单核细胞趋化因子1基因的表达

　　作者：魏云鸿, 吴立荣， 方颖， 李屏， 沈正， 刘兴德 作者单位：贵阳医学院2005级硕士研究生，现工作单位昆明市延安医院干疗科。 (贵阳医学院附院 心血管科， 贵州 贵阳 550004)

　　【摘要】 目的： 探讨高危或极高危原发性高血压(EH)患者外周血单核细胞趋化因子1(MCP1)表达，为寻找高危或极高危EH患者的治疗手段提供理论依据。方法: 运用酶联免疫吸附(ELISA)法测定高危或极高危EH患者65例(EH1组)、低或中危EH患者35例(EH2组)和30例正常对照者外周血MCP1蛋白含量，用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测外周血单个核细胞中MCP1 mRNA的表达。结果： 与对照组比较，EH1组和EH2组外周血MCP1蛋白含量和单个核细胞中mRNA表达均显著升高，具有统计学差异(P<0.05 or P<0.01);与EH2组比较，EH1组患者外周血MCP1蛋白含量和单个核细胞中mRNA表达均显著升高，具有统计学差异(P<0.01)。结论： 外周血单个核细胞中MCP1可能参与了高危或极高危EH的病理生理过程，外周血单个核细胞的MCP1 mRNA表达上调可能是高危或极高危EH患者外周血MCP1蛋白含量增高的机制之一。

　　【关键词】 高血压; 单核细胞趋化因子1; 血浆; 基因表达

　　Expression of Monocyte Chemotactic Protein1 in Peripheral Blood of Hypertension Patients in High or Very High Risk Grades

　　WEI Yunhong, WU Lirong, FANG Ying, LI Ping, SHEN Zheng, LIU Xingde

　　(Department of Cardiovascular Medicine, the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou， China)

　　[Abstract] Objective: To observe the level changes of protein and mRNA of monocyte chemoattractant protein1 (MCP1) in peripherial blood of patients with essential hypertension (EH) in high or very high risk grades. Methods: Concentrations of circulating MCP1 of 65 EH patients with high or very high risk (group EH1), 35 EH patients with low or moderate risk (group EH2), and 30 normotensive healthy people (group C) were tested with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and expression of MCP1 mRNA in peripherial blood mononuclearcells of the subjects were determined with RTPCR. Results: MCP1 protein level and intramononuclearcell expression of MCP1 mRNA in peripherial blood were significantly higher in groups EH1 and EH2 than in group C (P<0.05 or P<0.01), and were significantly higher in group EH1 than in group EH2 (P<0.01). Conclusions: MCP1 in peripherial blood might participate in the pathophysiology process of EH patients in high or very high risk grades; Expression increase of mRNA MCP1 may be one of the mechanisms of protein MCP1 increasing in peripherial blood in these patients.

　　[Key words] hypertension; monocyte chemoattractant protein1; plasma; gene expression

　　随着对原发性高血压(essential hypertension，EH)研究的深入，对EH的治疗理念已从单纯根据患者的血压级别进行治疗转变为同时根据血压级别和危险分层进行治疗。为提高患者生活质量，降低病死率，对高危或极高危EH患者在血压高于正常甚至在正常高值时即需药物治疗，使血压低于正常高值甚至更低一些，但单纯使用降压药物时常不能使此类患者的血压达到目标值。因此，积极探讨高危或极高危EH患者发病机制,无疑对此类患者的临床治疗具有重要的实用价值。美国波士顿哈佛医学院和得克萨斯大学研究发现，高血压与炎症有关[1]，炎症可能在EH的发病机制中起着重要的作用，但炎症介质与EH患者危险分层的关系少见报道。本研究拟检测高危或极高危EH患者外周血单核细胞趋化因子1(monocyte chemoattractant protein1，MCP1)蛋白水平及单个核细胞MCP1 mRNA的表达，探讨高危或极高危EH患者外周血单核细胞趋化因1(MCP1)变化，为寻找高危或极高危EH患者的治疗手段提供理论依据。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象及分组

　　按《中国高血压防治指南(2005年修订版)》制定的标准，选取2007 年2月～12月住院和门诊新诊断、或未经正规降压治疗的EH患者100例，其中高或极高危患者65例(EH1组)，低或中危患者35例(EH2组)，同时选取血压正常的30例健康体检者作为对照组。排除继发性高血压、血栓出血性疾病、糖尿病、高脂血症、感染、严重肝肾疾病、自身免疫性疾病及肿瘤性疾病患者，排除近期有手术或外伤史等影响MCP1的因素。

　　1.2 方法

　　1.2.1 主要试剂和仪器

　　人淋巴细胞分离液(上海捷瑞)，Trizol试剂(美国Invitrogen)，焦炭酸二乙酯(瑞兴)，逆转录试剂盒(Promega)，PCR试剂盒(Promega);100 bp DNA Ladder Marker，D2000 DNA Marker(天根生化)，人MCP1 ELISA 试剂盒(美国R&D公司);ULT1 386-3三洋-80 ℃低温冰箱(日本)，5745台式冷冻离心机(德国)，Eppendorff centrifuge 5810 R 高速离心机，Amersham核酸蛋白分析仪，PCR仪(PE geneAmp PCR System 2 400)(Perkin Elmer)，DNA成像分析仪(Gel Doc EQ)(BioRad)，酶标仪(ELx800)(BioTek公司)。引物设计由上海生工合成，MCP1：上游引物5' AGGAAGATCTCAGTGCAGAGG 3'，下游引物5' – AGTCTTCGGAGTTTGGGTTTG 3'。β-action：上游引物5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT 3'，下游引物5'GGGCACGAAGGCTCATCATT 3'。

　　1.2.2 标本采集

　　受检者空腹12 h，次日清晨6∶00～7∶00时，采集肘正中静脉血8 ml，其中4 ml置普通生化管中，室温静置2 h，自然凝固后离心，1 000 r/min，离心10 min，收集上清液置于-80 ℃冰箱保存待测;另4 ml置于EDTA抗凝试管中摇匀后即刻置40 ℃冰箱冷存，于6 h内提取RNA用。

　　1.2.3 外周血MCP1蛋白含量测定

　　用保存待测的血清，依照MCP1 ELISA试剂盒说明书的步骤操作。用酶标仪检测450 nm波长下各孔吸光度，根据吸光度值计算标本中MCP1的浓度。

　　1.2.4 人血单个核细胞中RNA提取和逆转录

　　聚合酶链反应(RTPCR) 淋巴细胞分离液提取外周血中单个核细胞后，按照说明书的步骤提取总RNA，进而按逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA并用PCR技术扩增目的片段。PCR产物用1.5% 琼脂糖凝胶跑电泳，溴乙锭显色。测定各条带灰度值，以βactin为内参，用MCP1与βactin的灰度比值定量MCP1。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析处理，数据以(x±s)表示，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

　　2 结果

　　2.1 基本资料

　　EH1组、EH2组及对照组的基本资料见表1。表1 EH1组、EH2组及对照组的基本资料(略)

　　2.2 外周血MCP1水平及单个核细胞MCP1 mRNA表达

　　EH1组患者外周血MCP1水平及单个核细胞MCP1 mRNA表达 由表2可见，与对照组比较，EH1组和EH2组患者外周血MCP1蛋白含量和单个核细胞中mRNA表达均显著升高，具有统计学差异(P<0.01，P<0.05);与EH2组比较，EH1组患者外周血MCP1蛋白含量和单个核细胞中mRNA表达均显著升高，具有显著统计学差异(P<0.01)。表2 各组外周血MCP1的表达(略)

　　3 讨论

　　EH是最常见的心血管疾病之一。传统观念认为，EH是多种因素(包括神经、体液、内分泌等)引起的血液流变学异常，表现为心搏出量和(或)外周阻力增加，治疗目标也仅限于用药物控制血压。对EH发病机制的深入研究发现，在EH发生发展的不同阶段，血管炎症是一个主要的、共同的病理特征，提示EH与炎症关系密切[2]。

　　MCP1为碱性蛋白，属于趋化因子超家族，可由炎症介质刺激的单核-巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞及平滑肌细胞等分泌。MCP1在体内及体外均有强大的诱导单核-巨噬细胞聚集、附壁、游走的功能，是炎症的始动因子及标志[3]。近年来研究发现，原发性高血压患者外周血MCP1蛋白含量升高，认为EH可能是一种慢性炎症过程[4]。本研究显示，与对照组比较，高或极高危EH组、低或中危EH组患者外周血MCP1蛋白含量均显著升高，具有统计学差异;与低或中危组比较，高或极高危组EH患者外周血MCP1蛋白含量显著升高，具有显著统计学差异。提示MCP1可能参与了高或极高危EH的病理生理过程，同时提示MCP1可能参与了EH患者的危险分层。因此，积极探索控制炎症的方法可能是治疗高或极高危EH患者策略之一。

　　高或极高危EH患者外周血MCP1升高的机制尚不十分明了，有研究发现升高的血压作用于血管壁，激活核因子κB信号途径，诱导内皮细胞、单核细胞和B细胞活化而表达MCP1[5]，但外周血MCP1蛋白的升高是否与外周血单个核细胞中MCP1 mRNA表达上调有关尚未见报道。本研究显示，外周血单个核细胞的MCP1 mRNA表达上调可能是导致高或极高危EH患者外周血MCP1蛋白含量升高的一个因素。MCP1蛋白可能进一步通过激活细胞因子受体趋化因子受体，介导趋化活性，使单核细胞和巨噬细胞发生移行，黏附于血管内皮细胞，进一步损伤血管内皮[6]，使其产生更多的炎症因子，加速血管重构，使血管壁顺应性下降，从而使血压进一步升高。

　　【参考文献】

　　[1]　Sesso H, Buring J, Rifai N,, et al.Creactive protein and the risk of developing hypertension[J]. JAMA, 2003(290):2945-2951.

　　[2]　Li JJ, Fang CH, Hui RT.Is hypertension an inflammatory disease[J] Med Hypotheses, 2005(64):236-240.

　　[3]　De Lemos JA,Morrow DA,Sabatine MS,et al. Association between plasma levels of monocyte chemoattractant protein1 and longterm clinical outcomes in patients with acute coronary syndromes [J]. Circulation, 2003(107):690-695.

　　[4]　Madej A, Okopien B,Kowalski J,et al.Plasma concentrations of adhesion molecules and chemokines in patients with essential hypertension [J]. Pharmacol Rep, 2005(6):878-881.

　　[5]　RodriguezIturbe B, Ferrebuz A,Vanegas V,et al.Early and sustained inhibition of nuclear factorkappaB prevents hypertension in spontaneously hypertensive rats [J].J Pharmacol Exp Ther,2005(1):51-57.

　　[6]　Ridker PM,Buring JE,Rifai N.Soluble Pselectin and the risk of future cardiovascular events[J]. Circulation, 2001(103):491-495.