新型亲水涂层冠脉支架对兔血栓的影响

　　作者：赵 雷 李淑梅 张吉凤1 赵佳怡2 张基昌 作者单位：吉林大学白求恩第二医院心血管内科，吉林 长春 130041)

　　【摘要】 目的 将医用316L不锈钢裸金属支架硅烷化处理后制成不同亲水程度的表面改性冠脉支架，并检验其血液相容性。方法 选取实验用新西兰大白兔25只，随机分为3巯丙基三甲氧基硅烷亲水涂层支架组(A组)、3(2氨乙基)氨丙基三甲氧基硅烷亲水涂层支架组(B组)、裸支架组(C组)、紫杉醇药物涂层支架组(D组)、未植入支架阴性对照组(E组)，每组5只。将各种支架分别植入相应A、B、C、D组兔腹主动脉，于第1、2、4周抽血检测兔血清CRP、sVCAM1、MMP9水平;第4周行腹主动脉血管内超声(IVUS)检查，观察各支架内皮化程度及表面血栓形成情况。结果 第1、2、4周植入支架各组兔血清CRP、sVCAM1、MMP9水平较E组均明显升高(P<0.05);血清CRP水平第4周A组较B、C、D组明显升高(P<0.05)，第4周B组与C、D组比较有显著差异(P<0.05);血清sVCAM1水平A、B、C、D各组植入支架后第2、4周较第1周无明显差异，B、D组各周均明显低于A组(P<0.05)，B组第4周与D组比较有显著差异(P<0.05);血清MMP9水平A、B、C、D组植入支架后第4周较第1、2周均明显升高(P<0.05)，C组第2、4周与A组相比无明显差异，第4周A组明显高于B组，D组则明显低于B组(P<0.05);第4周IVUS B组支架较C、D组支架血小板吸附少，支架表面没有形成血栓，内皮化程度好。结论 适度的亲水改性可增加冠脉支架的血液相容性，但过度亲水反而易形成血栓。

　　【关键词】 亲水;冠脉支架;血栓

　　经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)是广泛应用于临床的冠心病重建血运的最有效方法之一，但早期的裸支架再狭窄率较高;目前临床广泛应用的药物洗脱支架虽然再狭窄率明显下降，但易于形成血栓〔1〕。在血栓形成的过程中，除内膜损伤，血小板黏附、聚集和活化外，材料表面的物理化学特性及材料的血液相容性也是一个重要因素。目前的各种支架材料的表面改良方法效果均不理想。本研究对316L不锈钢裸金属支架表面进行硅烷化处理，并接支不同的硅烷耦联剂，得到不同接触角的两种亲水表面涂层，并对具有该涂层的支架、裸金属支架及药物涂层支架进行血管内血栓形成及血液炎症因子等方面的比较，为制备具有良好生物相容性及减少血栓形成风险的新型冠脉支架提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 选取新西兰大白兔25只，体重2.5～3.0 kg，雌雄不限。随机分为3巯丙基三甲氧基硅烷亲水涂层支架组(A组)、3(2氨乙基)氨丙基三甲氧基硅烷亲水涂层支架组(B组)、裸支架组(C组)、紫杉醇药物涂层支架组(D组)、未置入任何支架阴性对照组(E组)，每组5只。所有实验兔体重、长度、月龄、植入支架材料前造影腹主动脉直径、血管内超声检测动脉粥样斑块情况等无显著性差异，具有可比性。

　　1.2 方法

　　1.2.1 亲水涂层支架的制备 将医用316L不锈钢裸金属支架用丙酮超声处理15 min，之后在去离子水中超声波清洗30 min，用15% HCl溶液煮沸处理10 min后分别用蒸馏水、乙醇超声处理至洁净为止。将处理好的支架置入配置好的硅烷溶液中形成硅烷化表面，随后以3巯丙基三甲氧基硅烷及3(2氨乙基)氨丙基三甲氧基硅烷分别与之反应形成具有不同亲水性的新型支架样品A和B，每组5个样品。

　　1.2.2 实验步骤 将A、B、C、D组实验兔应用2%戊巴比妥钠麻醉，切开并分离右侧股动脉，置入4F动脉鞘管，DSA下行腹主动脉造影，将相应支架分别置入对应组兔腹主动脉并扩张，然后行腹主动脉造影及血管内超声(IVUS)检查。E组实验兔未植入支架，但仍行腹主动脉造影及IVUS检查。撤出鞘管后结扎股动脉并缝合创口，术后均未服用抗凝血药物。第4周再次麻醉所有实验兔后，切开并分离左侧股动脉，置入4F动脉鞘管，复查腹主动脉造影及IVUS检查后处死所有实验兔。

　　1.3 检测方法 术后1、2、4 w分别检测各组兔血清C反应蛋白(CRP)、sVCAM1、基质金属蛋白酶9(MMP9)水平。CRP测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法，将不同支架组分离获得的血清加到酶标板对应的孔中，37℃孵育90 min，洗板3次，加入酶标二抗，37℃孵育60 min。洗板3次，加入显色剂，避光37℃孵育30 min。加入终止液，混匀后用酶标仪(492 nm)测吸光度A值。sVCAM1测定采用ELISA法，将不同支架组分离获得的100 μl血清与100 μl标准品加入相应反应孔中，封住板孔，37℃孵育60 min。洗板3次，加入100 μl Biotin，37℃孵育60 min，洗板同前，加入100 μl HRP，37℃孵育30 min，每孔加入100 μl显色剂，避光显色30 min，加100 μl终止液于各孔中震荡混匀，用酶标仪在450 nm处测吸光度A值。MMP9测定采用ELISA法，将不同支架组分离获得的100 μl血清与50 μl标准品加入相应反应孔中，37℃孵育60 min。洗板5次，加入底物A，37℃孵育60 min，洗板同前，加入底物B，37℃孵育15 min，加入终止液，混匀后，加入显色剂，避光孵育30 min后，用酶标仪在450 nm处测吸光度A值。

　　1.4 统计学处理 全部数据采用SPSS11.0软件进行统计学处理。计量资料用x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，治疗前后比较采用配对t检验，率的比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 支架置入后兔血清CRP水平的变化 见表1。A、B、C、D组置入支架后CRP水平较E组均明显升高(P<0.05)。其中A、D组第4周血清CRP水平较第1、2周明显升高(P<0.05)，A组第4周血清CRP水平较B、C、D组明显升高(P<0.05)，B组第4周血清CRP水平与C、D组比较有显著差异(P<0.05)。表1 支架置入后实验兔血清CRP水平与E组比较：1)P<0.05，与第4周比较：2)P<0.05，与A组比较：3)P<0.05，与B组比较：4)P<0.05

　　2.2 支架置入后兔血清sVCAM1水平的变化 见表2。A、B、C、D组置入支架后sVCAM1水平较E组均明显升高(P<0.05)。A、B、C、D组置入支架后第2、4周血清sVCAM1水平较第1周虽均有不同程度的升高，但差异无显著性。其中B、D组各阶段血清sVCAM1水平明显低于A组(P<0.05)，第4周血清sVCAM1水平B组与D组比较有显著差异(P<0.05)。

　　2.3 支架置入后兔血清MMP9水平的变化 见表3。A、B、C、D组置入支架后血清MMP9水平较E组均明显升高(P<0.05)。A、B、C、D组植入支架后第4周血清MMP9水平较第1、2周明显升高(P<0.05)。C组第2、4周血清MMP9水平与A组相比无明显差异，第4周血清MMP9水平A组明显高于B组(P<0.05)，D组则明显低于B组(P<0.05)。表2 支架置入后实验兔血清sVCAM1水平表3 支架置入后实验兔血清MMP9水平与E组比较：1)P<0.05，与第4周比较：2)P<0.05，与B组比较：3)P<0.05

　　2.4 血栓及内皮化结果 见图1。B组与C组支架表面几乎没有血栓形成，B组内皮化程度略差于C组，但好于D组。A组2只兔、D组3只兔表面有血栓形成，表面部分内皮化。

　　图1 各组支架植入4 w后血管内超声检测结果

　　3 讨 论

　　临床广泛应用的药物洗脱支架其长期效果和潜在的危险性还有待进一步观察，目前尚无一种支架能够解决再狭窄及血栓形成等问题〔2〕。为解决这些问题，目前的研究多集中于支架表面材料的改性，以减少材料接触血液后引起的凝血过程。异物进入血液后会吸附血浆中的蛋白质，一方面触发以凝血因子活化为起点的内源性凝血反应，另一方面血小板附着于吸附的蛋白质表面并发生变形及活化，激活凝血反应，形成血栓〔3〕。材料表面蛋白吸附层的组成、立体构象和结合强度是由材料的表面特性决定的，当材料表面呈现亲水状态即接触角减小时，以吸附白蛋白为主，而接触角增大时则以吸附球蛋白为主〔4〕，而表面吸附了白蛋白可减少血小板的贴壁，表面吸附球蛋白特别是纤维蛋白原及γ球蛋白(以IgG为主)时，将发生大量的血小板黏附在材料表面，从而激活凝血过程〔5〕。

　　本研究合成的两种亲水的材料，其接触角3巯丙基三甲氧基硅烷亲水涂层支架为40°，3(2氨乙基)氨丙基三甲氧基硅烷亲水涂层支架为60°，结果显示3巯丙基三甲氧基硅烷亲水涂层支架亲水程度更强的材料并没有预期因为吸附较多的白蛋白减少血栓的形成，而3(2氨乙基)氨丙基三甲氧基硅烷亲水涂层支架则表现了良好的抗血栓特性，且内皮化程度要优于裸支架及紫杉醇药物涂层支架，其原因可能与炎症因子及促凝血因子的激活有关〔6〕。CRP是纤维蛋白原的一种趋化因子，纤维蛋白原使巨噬细胞黏附到内皮表面，同时激活凝血Ⅶ因子，引起凝血反应及血小板的聚集;sVCAM1为内皮细胞表达，并通过白细胞上的配体CD11/ CD18复合物与任何白细胞相互作用，使循环血液中单核细胞黏附，从而激活炎症反应及凝血过程〔7〕。同时较强的亲水性反而使支架内血栓形成的风险明显增加，提示材料表面具适宜的亲疏水平衡才有利于内皮细胞的生长及减少血栓形成的风险，在亲水涂层的表面适度接支疏水基团，可以改善涂层材料的血液相容性。MMP9一方面可以激活黏附分子的活性〔8〕;另一方面可以促进平滑肌细胞迁移及内膜增厚〔9〕，因此MMP9更多的是反映支架内血管再狭窄的指标，而3(2氨乙基)氨丙基三甲氧基硅烷亲水涂层支架该指标虽优于裸金属支架，但并不强于现有的药物涂层支架，提示在预防支架内再狭窄方面，亲水涂层支架仍需继续改进

　　【参考文献】

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