磷酸肌酸对大鼠缺血再灌注损伤心肌线粒体MDA、SOD和Ca2+表达的影响

　　作者：孟祥雁 包晓群 罗媛媛 高长斌 作者单位：吉林大学中日联谊医院心内科，吉林 长春 130033

　　【摘要】目的 探讨磷酸肌酸(PCr)对缺血再灌注(I/R)损伤心肌线粒体的影响。方法 采用大鼠左冠状动脉前降支结扎法建立大鼠I/R模型。60只雄性大鼠随机分为缺血再灌注(I/R)损伤组、假手术组、PCr组，假手术组只剖胸不结扎冠状动脉，余两组制作I/R模型，PCr组结扎前45 min经股静脉注射PCr 4 mg/kg，假手术组和I/R组分别静脉注射相应体积的生理盐水，在缺血45 min及2 h时测定I/R区心肌丙二醛(MDA)、超氧化物歧化物(SOD)及总Ca2+浓度。结果 与假手术组比较I/R损伤组MDA、总钙显著增高(P<0.05)，SOD显著降低(P<0.01);与I/R损伤组比较，PCr组MDA含量及总钙水平显著降低(P<0.05)，SOD显著增高(P<0.01)。结论 PCr对心肌I/R损伤有保护作用。

　　【关键词】 磷酸肌酸;缺血再灌注损伤;线粒体

　　心肌缺血时磷酸肌酸(PCr)是一种最主要最直接的功能物质，而内源性PCr极其有限的，所以提供外源性PCr参与细胞能量的供应可解决心肌保护的根本问题——能源。国外学者对于外源性PCr能否补充恢复耗尽的能量储备，作了大量研究，并证明PCr是一种极易被心肌细胞使用的能量形式〔1〕。通过PCr的标记实验发现心肌中有放射性分布，证明外源性PCr可以增加细胞内PCr的总体水平，而且当心肌缺血时，这种穿透力增强。本实验观察了PCr对体外大鼠心肌线粒体中丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活力和Ca2+浓度的影响，并探讨其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　成年雄性Wistar鼠60只，体重300～400 g，由吉林大学医学实验室提供，合格证号：吉动质20051024。MDA、SOD、ATP酶检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供。台式高速离心机MC沪0000193(上海手术器械厂)，LMZ-Z二道描记式记录仪(成都仪器厂)，微型动物呼吸机(吉林大学第二医院中心实验室提供)。PCr由海口奇力制药有限公司提供，批号20050503。

　　1.2 模型制作及分组

　　60只大鼠随机分为假手术组(Sham)，缺血再灌注(I/R)损伤组，PCr组，每组20只。Wistar大鼠称重后术前禁食12 h，2.5%戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉后固定于手术台上，手术部位备皮、消毒，并连接心电图肢体导联。于3、4气管软骨环间行气管切开插管，接动物呼吸机(潮气量约20 ml/kg，呼吸频率60次/min)。沿左侧胸骨旁斜切口，依次切开皮肤、浅筋膜及深筋膜，钝性分离胸大肌和前锯肌，直至暴露出肋骨及肋间肌，于左胸3、4肋间开胸(钝性分离肋间肌)，用开胸器撑开肋间，暴露心脏，剪开心包，挤出心脏。以无损伤缝合线(70)在左心耳根部和肺动脉圆锥左缘交界处下方1 mm处穿过左冠状动脉前降支，而后迅速将心脏放回胸腔，并将缝线扎紧。此时观察心电图变化，若肉眼观察结扎区变为紫色，同时QRS波增高、增宽及不同肢体导联出现ST段弓背上抬0.2 mV以上，持续30 min则为结扎成功。结扎45 min后松解结扎线使之再灌4 h，即为心肌I/R模型。假手术组只在左冠状动脉前降支下穿线，不结扎，余步骤同上〔2〕。建立大鼠I/R模型后，PCr组在结扎前45 min经股静脉注射PCr 4 mg/kg，假手术组和I/R组则静脉注射相应体积生理盐水。

　　1.3 心肌线粒体的分离提取

　　摘取大鼠左心室结扎线以下游离的心室壁心肌0.2 g，用冰生理盐水洗净，倒入玻璃匀浆管中，加入9倍于心脏重量的冰冷匀浆介质，将玻璃匀浆管插入盛有冰水混合物的容器中匀浆，将制备好的匀浆移入2 ml离心管，用低温低速离心机以2 000 r/min离心10 min，4℃离心15 min，弃上清沉淀物即为线粒体，将分离的线粒体用20倍的冰冷匀浆介质制备成混悬液，0℃～4℃储存待测。

　　1.4 大鼠心肌线粒体SOD及MDA含量的测定

　　取各组线粒体混悬液，采用硫代巴比妥酸法〔3〕，按照MDA测定试剂盒说明书的步骤进行，SOD检测采用黄嘌呤氧化酶法。

　　1.5 大鼠心肌细胞线粒体Na+K+ATP、Ca2+Mg2+ATP酶活性测定

　　取各自线粒体混悬液，按文献方法〔4〕配制反应介质，总ATP酶反应介质(mmol/L)：咪唑100，CaCl2 2.5，KCl 0.1，MgCl2 0.1，ATP 2，Na 4，线粒体膜蛋白60 μg，Mg2+ATP酶反应介质为上述介质， CaCl2 2加4 mmol/L ED7A，总反应体积0.4 ml，37℃反应10 min，用冷10%三氯醋酸终止反应，离心后吸取上清液测定无机磷含量、Ca2+Mg2+ATP酶活性含量，具体测定按照ATP测定试剂盒说明书步骤进行。

　　1.6 统计学处理

　　所有数据用x±s表示，采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析检验。

　　2 结果

　　2.1 PCr对心肌I/R损伤大鼠线粒体MDA、SOD、 Ca2+的影响

　　与假手术组比较，I/R损伤组大鼠血清MDA、Ca2+含量明显增加(P<0.05)，SOD活性明显降低(P<0.01)。与I/R损伤组比较PCr组能明显降低大鼠血清MDA含量、Ca2+含量(P<0.05)，SOD活性明显提高，见表1。表1 各组大鼠心肌线粒体中MDA、SOD、Ca2+的变化(略)

　　2.2 PCr对I/R损伤大鼠线粒体Na+K+ATP、Ca2+Mg2+ATP活力的影响

　　与假手术组比较，I/R损伤组大鼠血清Na+K+ATP、Ca2+Mg2+ATP活性明显降低(P<0.01)，与I/R损伤组相比PCr组血清Na+K+ATP、Ca2+Mg2+ATP的活性明显升高(P<0.01)，见表2。表2 PCr对大鼠心肌细胞线粒体ATP酶活力的影响(略)

　　3 讨 论

　　PCr是参与细胞能量代谢重要的物质之一，也是细胞重要的能量供应源ATP的补充，而ATP是任何细胞代谢过程中最重要的能量源〔5〕。线粒体在心脏的主要功能是合成ATP并维持Ca2+平衡，这两个过程有赖于线粒体膜内的电子转运所产生的H+化学梯度，在有氧的生理条件下，线粒体内的Ca2+浓度增加，刺激三羧酸循环和辅酶I〔NADH〕的氧化还原产生ATP〔6〕。而在心肌缺血缺氧条件下，有氧氧化受抑制，ATP产生不足，Na+K+ATP酶活性受抑制，细胞内Na+增多，无氧酵解增强，乳酸堆积，造成H+蓄积，细胞内酸中毒，Na+H+交换被激活，也使细胞内Na+浓度增多，进而激活Na+Ca2+泵，造成Ca2+超载，线粒体内Ca2+聚集可引起膜通透性改变，导致线粒体肿胀，造成不可逆损伤。当再灌注时，大量氧供虽能使线粒体呼吸链功能有所恢复，但也可引起大量氧自由基产生和细胞内Ca2+聚集，钙超载可激活磷脂酶，进一步加重膜损伤。本实验观察到心肌I/R损伤后，I/R组线粒体的Ca2+水平显著高于假手术组，而PCr组的Ca2+水平显著低于I/R组，说明心肌I/R损伤可导致线粒体内钙聚集，PCr可减轻线粒体内Ca2+聚集，其作用机制可能是影响L型钙离子通道(IcaL)。因为缺血、酸中毒、缺氧可以明显抑制IcaL通道，缺血以及酸中毒可以降低肌浆网Ca2+泵，Na+K+ATP酶功能，通过Na+/H+交换、Na+/Ca+交换造成细胞内Ca2+超载，从而抑制IcaL通道，酸中毒可以降低通道的电导以及开放数量和开放时间，IcaL通道aIC亚基的半胱氨酸残基对缺氧十分敏感，低氧分压可直接对通道产生抑制。PCr可明显增加缺血时受抑制的IcaL通道。PCr的作用机制可能不单纯是ATP合成的底物，它主要是通过保护和维持腺嘌呤核苷酸池，保护线粒体，促进ADP的再磷酸化，加快ATP的合成再转化，从而减轻细胞内钙超载、酸中毒，解除其对IcaL的抑制，PCr通过IcaL的电流，促进了兴奋收缩耦联〔4〕。此外，PCr还可以通过影响细胞代谢，减慢糖酵解的速度，降低H+的产生，保护线粒体的氧化功能，抑制Ca2+引起的线粒体肿胀〔7〕。

　　心肌I/R损伤可以产生大量的氧自由基，氧自由基的生成及由它引起的细胞膜脂质过氧化是心肌I/R损伤的重要机制之一。SOD是体内重要的氧自由基清除剂，MDA则为脂质过氧化代谢产物，心肌I/R损伤时其含量增加，PCr能保护SOD的活性，减少膜脂质过氧化，使MDA含量降低。有研究显示：PCr可通过提高氧自由基清除酶活力，抑制氧自由基对细胞膜脂质过氧化反应，稳定膜结构，减少细胞内酶的漏出，发挥对心肌缺血的保护作用〔6〕。这可能是PCr保护心肌I/R损伤的机制之一。机体通过产生氧自由基引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物如MDA等，氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤的程度，SOD能清除超氧离子的自由基，保护细胞免受损伤，SOD的活力高低间接反映了机体清除自由基的能力。本实验结果显示，I/R损伤后线粒体MDA含量较假手术组显著增加，而抗氧化损伤和清除自由基能力下降，用PCr不仅能减轻I/R心肌线粒体的脂质过氧化损伤，而且能通过提高线粒体内SOD的活性，增强其清除自由基的能力。

　　【参考文献】

　　1 Ruda M，Sarnarenko M，Afonskaya N，et al.Reduction of ventricular arrhuthmias by phosphorcreatine in patients with acute myocardial infarction〔J〕.Am Heart J，1988;116(3)：3938.

　　2 Palojoki E，Saraste A，Eriksson A，et al.Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001;208(6)：H272631.

　　3 李沛清，王 燕.参康心胶囊对小鼠心肌线粒体损伤保护作用〔J〕.中医药学报，2007;35(1)：1920.

　　4 Ferrari R，Repi P，Ferrari F，et al.Metabolic dangement in ischemic heart disease and its therapeutic control〔J〕.Am J Cardiol，1998;82(5A)：2K13K.

　　5 张 彬，赵 宏.磷酸肌酸心肌保护机制及其在心脏疾病中的应用〔J〕.医学综述，2008;14(2)：262.

　　6 赵艳芳，秦永文.曲美他嗪对大鼠缺血再灌注心肌线粒体的保护作用〔J〕.医学研究生报，2005;5(18)：114.

　　7 袁 彪，朱朗标，王冬青，等.外源性磷酸肌酸对离体鼠能量代谢及线粒体功能的影响〔J〕.中国胸心血管外科临床杂志;2000;7(3)：1789.