钙调神经磷酸酶对钙化血管蛋白激酶G表达的影响

　　作者：苑晓烨 李绍冰 曾强 李芳 姚丽霞 杨爽 郑敬 陈丽 刘彩霞 作者单位：河北省人民医院老年心血管病科，河北 石家庄 050051

　　【摘要】 　　目的 探讨钙调神经磷酸酶(CaN)对钙化血管蛋白激酶G Iα (PKG Iα) 蛋白及mRNA表达的影响。方法 SD雄性大鼠分为对照组、钙化组及环孢霉素A(CsA)组。采用华法林和维生素D3建立大鼠主动脉钙化模型。9 d后HE染色及VonKossa染色观察血管形态及钙沉积改变，应用免疫组化法测定PKGⅠα蛋白及CaNB1蛋白，原位杂交法测定PKGⅠα及CaNAα mRNA，测定CaN和碱性磷酸酶(ALP)活性。结果 钙化组PKG Iα蛋白和mRNA表达明显减少，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，CaNB1蛋白和CaNAα mRNA表达明显增加，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。结论 CaN能够抑制钙化血管中PKG Iα蛋白及mRNA的表达。

　　【关键词】 华法林;维生素D3;血管钙化;钙调神经磷酸酶;环鸟苷酸依赖的蛋白激酶;环孢霉素A

　　Regulation of expression of cGMPdependent protein kinase Iα by calcineurin in vascular calcification

　　YUAN XiaoYe, LI ShaoBing, ZENG Qiang, et al.

　　Cardiovascular Department of Gerontology, Hebei Provincial People′s Hospital，Shijiazhuang 050051，Hebei，China

　　【Abstract】 Objective To discuss the regulation of expression of cGMPdependent protein kinase Iα (PKG Iα protein and mRNA) by calcineurin (CaN) in vascular calcification. Methods Rat vascular calcification model was made by subcutaneously injection of warfarin and Vitamin D3. 4weeksold male SD rats were randomly divided into 3 groups: normal control, calcification and CsA groups. Samples from 6 rats of each group were used for immunohistochemistry to examine the expressions of PKGⅠα protein and CaNB1 protein as well as for in situ hybridization to detect the expressions of PKGⅠα mRNA and CaNAα mRNA. The others were used to detect activities of CaN and alkaline phosphatase (ALP) in rat aorta. Results Expressions of PKGⅠα　protein and mRNA in rat aorta from calcification group depressed, and expressions of CaNB1 protein, CaNAα mRNA was elevated significantly. Conclusions CaN can inhibit the expression of PKG Iα protein and mRNA in vascular calcification.

　　【Key words】 Warfarin; Vitamin D3; Vascular calcification; cGMPdependent protein kinase;Calcineurin; Cyclosporin A

　　血管钙化是动脉粥样硬化、糖尿病、肾病、衰老、收缩期高血压及骨质疏松等多种疾病的病理基础，尤其与动脉粥样硬化关系密切，可以导致血栓形成、粥样硬化斑块破裂等严重后果。血管钙化与骨代谢及血管平滑肌细胞 (VSMC) 表型转换关系密切。环三磷酸鸟苷依赖的蛋白激酶I (PKG I) 及钙调神经磷酸酶 (CaN) 在参与调节血管平滑肌细胞增殖及骨代谢中发挥重要作用。既往在对VSMC的研究中发现，CaN蛋白和mRNA可抑制VSMC增殖中PKG Iα蛋白和mRNA表达〔1〕。但是在钙化血管中CaN蛋白和mRNA对PKG Iα蛋白和mRNA是否有调节作用尚不清楚，本研究旨在探讨CaN蛋白和mRNA在钙化血管中对PKG Iα上述二者表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　华法林、维生素D3购自Sigma公司;环孢霉素A(CsA)购自Novartis公司;维生素K1为无锡市第七制药有限公司生产;SD雄性大鼠购自河北医科大学实验动物中心。

　　1.2 动物分组及钙化血管的制备

　　参照文献〔2〕将实验动物随机分为对照组、钙化组、钙化+CsA组(CsA组)，每组12只。实验第1～8天，各组均给予维生素K1 15 mg·kg-1·d-1，皮下注射，同时CsA组另给予CsA 10 mg·kg-1·d-1腹腔注射，对照组和钙化组分别给予等量生理盐水腹腔注射;实验第3天开始，钙化组和CsA组另给予维生素D3 3×105 U·kg-1·d-1，皮下注射，持续至第5天，及华法林15 mg/100 g，12 h一次，皮下注射，持续至第8天，对照组在相同时间给予等量生理盐水皮下注射;实验第9天，所有动物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后处死。

　　1.3 标本处理

　　大鼠处死前12 h禁食不限水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，将大鼠置于冰盒上，开胸，暴露出心脏，分离胸主动脉，并向下剖开腹部，分离出腹主动脉，从主动脉根部至腹主动脉分叉处剪下主动脉，迅速置于4℃预冷的生理盐水中冲洗后置于有0.1%二乙基焦碳酸酯(DEPC)的多聚甲醛溶液中，经常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，每段血管均匀切片3～4张，分别做HE染色、VonKossa染色等形态学观察和免疫组化、原位杂交等检测，或置于液氮再转入-80℃冰箱待测组织酶活性。

　　1.4 原位杂交检测

　　CaNAα mRNA原位杂交检测试剂盒为天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品;PKGⅠα mRNA原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。杂交及杂交后检测按试剂盒说明进行。PKGⅠαmRNA探针合成序列为①5′AGACCTACAGGTCCTTCCACGACCTGCGCCAGGCG3′;②5′TGATCGACAATGTTTTCAAACAATAATGATGAGAA3′;③5′ACACGAGACAGCAGGAGCACATCCGCTCAGAGAAG3′。细胞质显棕黄色为阳性，细胞核为蓝色。CaNAαmRNA探针合成序列：①5′CGGTGACTTGGCGGAAATGGAACGGCTT;②5′AAGAAGAGGTAGCGAGTGTTGGCAGGAG;③5′CGAAGGCATCCATACAGGCGTCATA AAC。细胞质显棕黄色为阳性，细胞核为蓝色。将结果应用ImagePro Plus图像分析软件，分别计算各组主动脉组织相同面积内阳性细胞的累积光密度值(IOD)。

　　1.5 免疫组化检测

　　大鼠抗PKGⅠα IgM (一抗) 购于Santa公司，葡聚糖过氧化物酶复合物 (PKG二抗)购于北京中杉生物公司。大鼠抗CaNB1 IgM (一抗)、生物素化羊抗大鼠IgM (CaNB1二抗)购于武汉博士德生物工程有限公司。PKG免疫组化染色采用PV法，DAB显色，细胞质显棕黄色为阳性，胞核为蓝色。CaN免疫组化染色采用SP法，DAB显色，细胞质显棕黄色为阳性，胞核为蓝色;上述具体步骤均参照试剂盒说明书进行。图像分析同原位杂交。

　　1.6 HE染色

　　固定后的血管，经石蜡切片脱蜡、苏木素伊红染色，常规梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察结果。

　　1.7 血管组织VonKossa染色

　　石蜡切片脱蜡、焦性没食子酸还原、硫代硫酸钠定影、伊红复染、蒸馏水冲洗、常规梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察动脉钙化情况。钙化血管中膜弹性纤维间可见大量黑色颗粒沉积于细胞外基质，表明存在钙沉积。

　　1.8 主动脉组织CaN活性和碱性磷酸酶(ALP)活性测定

　　取主动脉组织于液氮中碾碎，在冰浴中匀浆，离心，弃沉淀，上清液即为所需的胞浆蛋白。组织蛋白定量方法、主动脉组织CaN活性测定、主动脉组织ALP活性测定均按试剂盒说明书操作。

　　1.9 统计学处理

　　数据以x±s表示，运用SPSS 13.0统计软件，对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验，组间资料比较应用单因素方差分析，两两比较应用LSDt检验。

　　2 结 果

　　2.1 组织形态学改变

　　2.1.1 HE染色

　　结果显示对照组大鼠主动脉壁结构完整，中层VSMC排列整齐;钙化组大鼠主动脉中层VSMC排列紊乱，弹力纤维迂曲断裂;CsA组大鼠主动脉中层VSMC亦排列紊乱，弹力纤维层迂曲断裂。

　　2.1.2 VonKossa染色

　　结果显示钙化组大鼠主动脉中层弹性纤维间有大量黑色颗粒沉积;CsA组大鼠主动脉中层弹性纤维间亦可见黑色颗粒沉积;对照组未见明显黑色颗粒沉积。

　　2.2 PKGⅠα原位杂交及免疫组化结果

　　各组大鼠主动脉可见PKGⅠα mRNA及蛋白表达，主要位于胞浆中。钙化组大鼠主动脉PKGⅠα mRNA及蛋白较对照组表达明显减少(P<0.01);CsA组大鼠主动脉PKGⅠα mRNA及蛋白较对照组及钙化组表达均明显增加(P<0.01)，见图1，表1。表1 各组主动脉组织相同面积内阳性细胞的累积光密度值(略)

　　2.3 CaNB1免疫组化结果

　　三组大鼠主动脉可见一定量CaNB1蛋白表达，主要位于胞浆内。钙化组及CsA组大鼠主动脉CaNB1蛋白较对照组表达明显增加(P<0.01);CsA组大鼠主动脉CaNB1蛋白表达较钙化组减少(P<0.05)，见表1。

　　2.4 主动脉组织CaN和ALP活性

　　钙化组和CsA组CaN活性均较对照组明显增加(P<0.01);CsA组CaN活性与钙化组比较无显著性差异(P>0.05)。钙化组及CsA组ALP活性较对照组也明显增加(P<0.05，P<0.01);CsA组ALP活性与钙化组比较无显著性差异(P>0.05)，见表2。表2 主动脉组织CaN活性和ALP活性测定(略)

　　2.5 CaNAα原位杂交结果

　　三组大鼠主动脉可见一定量CaNAα mRNA表达，主要位于胞浆内。钙化组及CsA组大鼠主动脉CaNAα mRNA较对照组表达明显增加(P<0.01);CsA组大鼠主动脉CaNAα mRNA较钙化组表达明显减少(P<0.01)，见表1。

　　3 讨 论

　　血管钙化是一个类似于骨形成的主动过程，包括基质小泡的出现、细胞内ALP活性增加以及VSMC发生成骨细胞/软骨细胞表型转化，并失去平滑肌特异性标记平滑肌肌动蛋白、平滑肌22α、平滑肌肌球蛋白重链 (SMMHC)，即去分化〔3〕等。许多骨相关蛋白和血管活性物质如骨形态发生蛋白2以及非胶原性基质蛋白如骨桥蛋白、骨连接素、骨钙素、骨唾液蛋白 (BSP)等都可能参与了钙化的调控。

　　本研究钙化血管中，大鼠主动脉PKGⅠα mRNA及蛋白表达减少，CaNAα mRNA及CaNB1蛋白表达增加，因此认为PKGⅠα及CaN可能参与了血管钙化。PKG存在于多种组织细胞，是重要的信号分子一氧化氮 (NO)的下游底物。NO能够激发多种信号传导通路，刺激鸟苷酸环化酶(rGCs) 催化细胞内环鸟苷酸(cGMP)合成，再由cGMP激活PKG调节局部和全身信号等。体外以及体内血管成形术后研究发现，在过度表达C型钠尿肽 (CNP可以激活rGCs) 的VSMC中，SMMHC2 mRNA和蛋白质的表达增加〔4〕，并且NO阻止了血小板衍生生长因子下调SMMHC启动子的作用〔5〕。CaN通过去磷酸化激活T细胞核因子NFATc1(CaN最重要的底物)，并与核内的转录因子GATA6相互作用，协同激活平滑肌特异性SMMHC的表达〔6〕。这些研究表明，PKG及CaN在VSMC表型调控中起着重要作用。此外，在骨代谢中均可见PKGⅠα及CaN的参与。Yaroslavskiy〔7〕等研究证实，在大鼠和人的破骨细胞培养组织基质中，cGMP激动剂和NO供体极大地增强了破骨细胞的运动。NO可调节骨形成和重吸收，缺少内皮一氧化氮合酶或者PKG的小鼠的骨发育不正常〔8～12〕;诱生一氧化氮合酶无效的小鼠，骨成骨作用发生失调〔13〕。Sun〔14〕等首先发现骨髓细胞、骨髓源性成骨细胞和前骨细胞(MC3T3E1)中表达CaNA和B的各种亚型，转导了TATCaNAα融合蛋白的MC3T3E1和新生小鼠颅骨细胞，成骨细胞分化标记小牛相关转录因子2(runtrelated transcription factor 2，Runx2)、BSP、ALP、降钙素等明显增加。NFATc1/小鼠的胚胎干细胞在破骨细胞分化必要信号——核因子κB受体活化因子配基 (RANKL)诱导下不能分化成破骨细胞，而过量表达NFATc1的破骨祖细胞缺乏RANKL的刺激，也能分化成破骨细胞〔15〕，由此推测，PKGⅠα及CaN在钙化血管中起着一定调控作用。

　　本实验给予CaN抑制剂CsA后，钙化血管中CaN B1蛋白和CaN Aα mRNA表达减少，而PKG Iα蛋白和PKG Iα mRNA的表达及钙化的标志物ALP却有增加的趋势，推测CaN(蛋白和mRNA)抑制钙化血管中PKG Iα(蛋白和mRNA)的表达，表明CaN介导的脱磷酸化和核转位作用在信号传导途径中可能是一中枢性事件。它不仅本身可介导多条信号传导通路，而且通过其去磷酸化作用可对其他信号通路进行调节，使Ca2+信号与其他第二信使的调节机制发生“交谈”，协同调节细胞的功能。在钙化血管中CaN激活，使受磷蛋白(PLB)去磷酸化而活化，PLB能够抑制肌浆网钙ATP酶(SERDA2a)的活性，减少肌浆网对胞浆内Ca2+的重吸收，使细胞质内Ca2+水平升高，上调一氧化氮合酶活性，NO水平增加，继而生成大量cGMP，激活蛋白激酶A，抑制PKG Iα表达〔16〕。当用特异性抑制物CsA阻断CaN活性后，上述过程被抑制，从而使PKG Iα表达增加。

　　在本研究中应用CaN特异性抑制剂CsA后，CaNB1蛋白、CaNAα mRNA的表达均减少，而钙化标志物ALP有增加的趋势，即血管钙化的程度有加重的趋势，但无统计学意义，可能与实验中存在误差或干预时间较短有关，很有可能是CsA破坏了CaN及PKG对血管平滑肌细胞表型的维持，使VSMC向成骨细胞样表型转变。

　　CaN是由催化亚基A和调节亚基B组成的异源二聚体。A亚单位有α、β、γ三个亚型，B亚单位有B1和B2两个亚型，CaNA是全酶的活性中心。本实验仅测定了CaNAα mRNA、CaNB1蛋白mRNA及蛋白在钙化血管的表达，CaNAβ对血管钙化是否有调节作用，以及在血管钙化的病理生理过程中Aα和Aβ之间是否存在相互代偿及可能存在的时空效应等还不清楚，尚待进一步研究。

　　总之，血管钙化可以引起血流动力学和机械力学的改变，动脉管壁僵硬，收缩压升高、舒张压降低，脉压差增大，冠状动脉灌注降低，最终将导致左室肥大、心肌缺血和心律失常，并增加脑卒中和猝死的危险〔17〕。明确CaN与PKG Iα之间的相互关系有助于了解血管钙化的可能发病机制，并为抗血管钙化的药物治疗提供了可能的新途径。

　　【参考文献】

　　1 孙宁玲，马 旃，李世军.血管平滑肌细胞增殖中蛋白激酶G与钙调磷酸酶信号通路的交互调节〔J〕.中国动脉硬化杂志，2006;14(8)：6458.

　　2 Price PA，Faus SA，Williamson MK.Warfarininduced artery calcification is accelerated by growth and vitamin D〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000;20(2)：31727.

　　3 Iyemere VP，Proudfoot D，Weissberg PL,et al.Vascualr smooth muscle cell phenotypic plasticity and the regulation of vascular calcification〔J〕.J Internl Med，2006;260(3):192210.

　　4 Doi K，Ikeda T，Itoh H,et al.Ctype natriuretic peptide induces redifferentiation of vascular smooth muscle cells with accelerated reendothelialization〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001;21(6)：9306.

　　5 Itoh S，Katoh Y，Konishi H.Nitric oxide regulates smoothmusclespecific myosin heavy chain gene expression at the transcriptional levelpossible role of SRF and YY1 through CArG element〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2001;33(1)：95107.

　　6 Wada H，Hasegawa K，Morimoto T,et al.CalcineurinGATA6 pathway is involved in smooth muscle specific transcription〔J〕.J Cell Biol，2002;156(6)：98391.

　　7 Yaroslavskiy BB，Zhang Y，Kalla SE,et al.NOdependent osteoclast motility：reliance on cGMPdependent protein kinase I and VASP〔J〕.J Cell Sci，2005;118(Pt 23)：547987.

　　8 Aguirre J，Buttery L，O′Shaughnessy M,et al.Endothelial nitric oxide synthase genedeficient mice demonstrate marked retardation in postnatal bone formation，reduced bone volume，and defects in osteoblast maturation and activity〔J〕.Am J Pathol，2001;158(1)：24757.

　　9 Chae HJ，Park RK，Chung HT,et al.Nitric oxide is a regulator of bone remodelling〔J〕.J Pharm Pharmacol，1997;49(9)：897902.

　　10 Chikuda H，Kugimiya F，Hoshi K,et al.Cyclic GMPdependent protein kinase Ⅱ is a molecular switch from proliferation to hypertrophic differentiation of chondrocytes〔J〕.Genes Dev，2004;18(19)：241829.

　　11 Miyazawa T，Ogawa Y，Chusho H,et al.Cyclic GMPdependent protein kinase II plays a critical role in Ctype natriuretic peptidemediated endochondral ossification〔J〕.Endocrinology，2002;143(9)：360410.

　　12 Otsuka E，Hirano K，Matsushita S,et al.Effects of nitric oxide from exogenous nitric oxide donors on osteoblastic metabolism〔J〕.Eur J Pharmacol，1998;349(23)：34550.

　　13 Van′t Hof RJ，Armour KJ，Smith LM,et al.Requirement of the inducible nitric oxide synthase pathway for IL1induced osteoclastic bone resorption〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(14)：79938.

　　14 Sun L，Blair HC，Peng Y,et al.Calcineurin regulates bone formation by the osteoblast〔J〕.PNAS，2005;102(47)：171305.

　　15 Takayanagi H，Kim S，Koga T,et al.Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts〔J〕.Dev Cell，2002;3(6)：889901.

　　16 Pilz RB，Casteel DE.Regulation of gene expression by cyclic GMP〔J〕.Circ Res，2003;93(11)：103446.

　　17 Raggi P，Bellasi A.Clinical assessment of vascular calcification〔J〕.Adv Chronic Kidney Dis，2007;14(1)：3743.