辛伐他汀对压力超负荷大鼠APN、IL6及心肌肥厚影响

　　作者：牛元坤，蔡尚郎 作者单位：青岛大学医学院附属医院心血管内科，山东 青岛 266003)

　　【摘要】 目的 观察辛伐他汀对压力超负荷大鼠血清脂联素(APN)、白细胞介素6(IL6)水平以及心肌肥厚的影响，探讨该类药物影响心肌肥厚可能的作用机制。方法 实验动物随机分对照组、心肌肥厚组、治疗组，每组10只。应用经典的腹主动脉结扎方法，制备压力超负荷大鼠模型。治疗组大鼠给予辛伐他汀5 mg/kg 每日清晨灌胃，连续6周。心肌肥厚组和对照组同时以同等剂量的9 g/L的氯化钠溶液每日清晨灌胃，直至术后6周。采用鼠尾测压法测定大鼠血压的变化;酶联免疫吸附试验法检测大鼠血清APN、IL6浓度。实时定量PCR检测心肌组织中IL6、脂联素受体1(AdipoR1)的mRNA表达。称量法计算各组大鼠心脏质量及心脏质量/体质量比值，并观察心肌的病理学改变。结果 心肌肥厚组大鼠血清APN水平、IL6水平、心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度、心肌细胞平均直径，以及心肌IL6、AdipoR1 mRNA表达与对照组相比差异有显著性(q=3.41～31.83,P<0.01)。治疗组大鼠与心肌肥厚组相比血清APN水平、IL6水平、心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度、心肌细胞平均直径以及心肌IL6、AdipoR1 mRNA表达差异有显著性(F=3.57～329.93,q=3.11～31.08，P<0.01)。结论 辛伐他汀可能通过增加血清APN的浓度以及心肌细胞因子的表达来抑制压力负荷增加引起的大鼠心肌肥厚。

　　【关键词】 心室重构;辛伐他汀;脂联素;白细胞介素6;大鼠,Wistar

　　脂联素(APN)是由脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白，与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病等病理改变有关。近年来发现它对心血管系统具有保护作用，但与高血压及其所致的心脏损害的关系尚不十分清楚。细胞因子在高血压等压力负荷增加引起心肌肥厚的过程中发挥着一定作用，这些因子在心肌中的表达水平可能与心肌肥厚密切相关。他汀类药物为3羟3甲基戊二酰辅酶A 还原酶(HMGCoA)抑制剂，除了降低胆固醇外，还具有“多效应作用”[1]，在改善心肌肥厚中的应用还处于探索阶段。本研究将辛伐他汀应用于大鼠心肌肥厚的动物模型，观察大鼠用药后心肌的病理改变以及血清APN水平、心肌细胞因子表达的变化，探讨辛伐他汀对心肌肥厚的影响及可能的作用机制，旨在为心肌肥厚的预防和治疗提供新的手段和方法。现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物及分组

　　SPF级Wistar雄性大鼠30只，体质量200～220 g,由我院实验动物中心提供。随机分成3组：对照组、心肌肥厚组及治疗组。 每组均为10只。

　　1.2 动物模型制备及各组处理

　　实验前各组大鼠均在实验室喂养1周，测定其基础血压。参照文献[2]的方法制备腹主动脉缩窄型大鼠心肌肥厚模型，大鼠经100 g/L的水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔麻醉后行剑突下正中切口，于双侧肾动脉分支近心端处将腹主动脉与七号针头结扎在一起后，抽出针头，脏器恢复原位，缝合切口。对照组只实行相同的手术程序，不结扎腹主动脉。术后3 d大鼠恢复后，从尾动脉测定收缩压，连续观察血压的变化。心肌肥厚模型选取术后2周血压维持在21.33 kPa以上的大鼠用于实验。术后2周治疗组大鼠给予辛伐他汀(由默沙东制药有限公司提供)5 mg/kg 每日清晨灌胃，连续6周。心肌肥厚组和对照组同时以同等剂量的9 g/L的氯化钠溶液每日清晨灌胃，直至术后6周。

　　1.3 取材

　　处死动物前称体质量，处死后取心脏称质量，计算心脏质量/体质量比值。在距心尖与心底等距离处横行切断心脏，心底端置40 g/L的甲醛溶液固定，进行病理学实验;心尖端置液氮保存，进行分子生物学实验。

　　1.4 大鼠血清APN、白细胞介素6(IL6)浓度检测

　　采用酶联免疫吸附实验法(ELISA)，实验方法参照试剂所提供操作指南，结果在全自动酶标仪上进行比色分析。

　　1.5 实时定量RTPCR检测心肌细胞脂联素受体1(AdipoR1)、IL6的mRNA的表达

　　取冻存心肌组织约100 mg，剪碎, 用Trizol试剂1 000 mL提取总RNA (具体步骤参见试剂说明书)。应用引物Oligod (T) 18 和Random逆转录合成cDNA。配置PCR体系，应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术扩增待测基因及内参基因所用引物。见表1。反应条件：第一次循环95 ℃ 10 s;然后以95 ℃ 5 s,60℃ 50 s,进行40次循环;最后进行溶解曲线分析。以阴性对照GAPDH作为参考，计算机分析Ct值，即每个反应管内荧光强度达到系统认为的有目的DNA合成时的循环数，用以评定各因子mRNA的实时定量相对表达水平。以上试剂及引物均由宝生物工程(大连) 有限公司提供。

　　1.6 病理学检测

　　将甲醛固定的心脏组织做成石蜡切片，经苏木精伊红染色后拍照，用ImagePlus图像分析软件测量左心室前壁、侧壁、后壁和室间隔的厚度，并取平均值即为左心室壁的平均厚度;在显微镜下放大40倍后再拍照，每张切片随机选取10个视野，每个视野选10个细胞，用ImagePro Plus软件测每个细胞的面积，取平均值后计算出其等效面积圆的直径，即为心肌细胞平均直径。

　　1.7 统计学处理

　　实验结果以±s表示，采用SPSS 11.5 统计软件进行单因素方差分析,两组间比较用q检验。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠血清脂联素、IL6水平的变化

　　腹主动脉结扎术后8周，心肌肥厚组大鼠血清脂联素、IL6水平与对照组比较差异有显著性(F=33.55、87.63,q=11.23、18.66,P<0.01);治疗组血清脂联素、IL6水平与心肌肥厚组比较差异有显著性(q=5.62、10.66,P<0.01)。见表2。

　　2.2 辛伐他汀对大鼠心脏病理学改变的影响

　　3组大鼠体质量比较差异无统计学意义。心肌肥厚组心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度、心肌细胞平均直径与对照组比较差异有显著性(F=3.57～329.93，q=3.41～31.83,P<0.01)。治疗组心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度、心肌细胞平均直径与心肌肥厚组比较差异有显著性(q=3.11～31.08，P<0.01);心脏质量、心脏质量/体质量比值与对照组比较差异无统计学意义(q=0.30、0.75，P>0.05);左心室壁平均厚度、心肌细胞平均直径与对照组比较差异有极显著性(q=6.64、3.89，P<0.01)。见表3。

　　2.3 辛伐他汀对大鼠心肌AdipoR1、IL6 mRNA表达的影响

　　实时定量PCR结果显示，心肌肥厚组大鼠心肌中IL6、AdipoR1 mRNA表达与对照组比较差异有显著性(F=19.73、56.45,q=8.89、13.44,P<0.01)。应用辛伐他汀治疗6周后大鼠IL6、AdipoR1 mRNA的表达与心肌肥厚组比较差异有显著性(q=4.44、12.54，P<0.01)。见表4。

　　表1 扩增待测基因及内参基因所用引物基因(略)

　　表2 各组大鼠血清脂联素、IL6水平的变化(略)

　　表3 辛伐他汀对大鼠心脏病理学改变影响(略)

　　表4 辛伐他汀对大鼠心肌细胞因子AdiptR1、IL6 mRNA表达的影响(略)

　　3 讨论

　　临床上高血压、心脏瓣膜病等压力负荷增加引起心肌肥厚，进而发展为心力衰竭较常见。近年来发现脂联素的缺乏与心肌肥厚有关。在脂联素缺乏的小鼠体内，压力超负荷导致心肌向心性肥厚与心肌细胞外信号调节激酶(ERK)增多和AMP激活的蛋白酶(AMPK)信号传递减少有关[3]。脂联素通过活化AMPK信号来调控缺血组织的血管生成[4],在这一过程中存在着一条重要的信号传导通路,即脂联素AMPK磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)一氧化氮合酶(NOS) 信号轴，在心肌培养中脂联素激活AMPK，从而抑制心肌肥厚的信号传递。IL6是最具代表性的致炎症细胞因子，其分泌与TNFα和IL1β直接相关,IL6 及其相关细胞因子通过剌激其共同的gp130 受体亚单位在心肌细胞的表达而影响心肌肥厚状况[5]。脂联素与炎性细胞因子的表达密切相关，脂联素可以通过调节ERK途径抑制 IL6的表达。炎症递质如TNFα和IL6 水平增高均能抑制和减少脂联素在脂肪组织中的表达和分泌[6]。

　　研究表明，他汀类药物除了降低胆固醇，还可能通过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) 信号转导通路影响脂联素水平，并通过核因子κB (NFκB)、活化蛋白1 (AP1)等多种途径调控IL6等炎性细胞因子的基因表达[7,8]。本研究结果表明，心肌肥厚组大鼠心肌细胞IL6表达增加，脂联素受体表达减少，血清脂联素水平下降，说明心肌细胞在病理状态下具有炎性细胞因子自分泌作用，且IL6和脂联素相互影响，这与国外报道的结果相一致。心肌肥厚大鼠给予辛伐他汀药物治疗后，与心肌肥厚组相比心肌细胞因子的表达减少，脂联素受体表达升高;血清脂联素水平上升，IL6水平下降。同时，还能使大鼠心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度和心肌细胞平均直径均降低。表明辛伐他汀能够在蛋白和转录水平改善IL6、脂联素及其受体的表达，这可能是辛伐他汀抑制压力负荷增加引起左心室肥厚的作用之一。

　　综上所述，辛伐他汀可纠正脂联素和细胞因子失衡，改善心肌肥厚。此为他汀类药物的新用途提供了有益的实验资料。但是,他汀类药物改善心肌肥厚的作用及其临床价值还有待于深入研究。

　　【参考文献】

　　[1]WASSMANN S, RIBAUDO N, FAUL A, et al. Effect of atorvastatin 80 mg on endothelial cell function (forearm blood flow) in patients with pretreatment serum lowdensity lipoprotein cholesterol levels <130 mg/dl[J]. Cardiol, 2004,93:8488.

　　[2]蔡智荣,孙婷. 心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡与依那普利干预治疗效果[J]. 青岛大学医学院学报, 2004,40(2):305307.

　　[3]KUBOTA N, TERAUCHI Y, YAMAUCHI T, et al. Disruption of adidonectincauses insulin resistance and neointimal formation[J]. J Biol Chem, 2002,277:2586325866.

　　[4]OUCHI N, KOBAYASHI H, KIHARA S, et al. Adiponectin stimulates angiogenesis by promoting crosstalk between AMPactivated protein kinase and Akt signaling in endothelial cells[J]. J Biol Chem, 2004,279:13041309.

　　[5]ORSHAL J M, KHALIL R A. Reduced endothelial NOCMPmediatedvascular relaxation and hypertension in IL6infused pregnant rats[J]. Hypertens, 2004,43:43444.

　　[6]葛庆峰,闫杰.急性心肌梗死患者血清脂联素水平的动态变化[J]. 临床荟萃, 2005, 20:601603.

　　[7]DECHEND R, FIEBELER A, PARK J K, et al. Amelioration of angiotensin induced cardiac injury by a 3hydroxyl3methylglutaryl coenzyme a reductase inhibitor[J]. Circulation, 2001,104(5):576.

　　[8]NIAN M, LEE P, KHAPER N, et al. Inflammatory cytokines and postmyocardial infarction remodeling[J]. Circ Res, 2004,94(12):15431553.