缬沙坦后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用

　　作者：宁险峰 作者单位：青岛大学医学院附属医院心内科，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 了解血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦后处理对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响及其机制。方法 将24只新西兰大白兔随机分为3组，每组8只。对照组结扎左冠状动脉前降支1 h，再灌注6 h;后处理组结扎左冠状动脉前降支1 h，于再灌注前15 min耳缘静脉注射缬沙坦(30 mg/kg)，再灌注6 h;药物干预组结扎左冠状动脉前降支1 h，于再灌注前15 min耳缘静脉注射缬沙坦(30 mg/kg)，再灌注前5 min给予蛋白激酶C抑制剂GF109203X (0.05 mg/kg)耳缘静脉注射持续5 min，最后心肌再灌注6 h。处死家兔，取缺血坏死区心肌常规制作石蜡切片，光镜下观察缺血坏死区心肌组织结构的变化，采用Tunel法检测心肌细胞凋亡程度，用免疫组化法检测心肌细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果 与对照组和药物干预组比较，后处理组心肌组织结构变化轻微，细胞凋亡指数明显降低(F=4.58，q=3.321、4.001，P<0.01)，Bcl-2表达明显增多(F=7.23,q=4.730、4.580，P<0.01)，Bax表达明显减少(F=8.35，q=4.684、5.275，P<0.01)。而药物干预组与对照组比较各检测指标差异无显著性(P>0.05)。结论 缬沙坦后处理可减少急性缺血再灌注后心肌细胞凋亡，并影响Bcl-2、Bax蛋白的表达，从而对缺血心肌产生保护作用，其保护机制可能与激活蛋白激酶C有关。

　　【关键词】 心肌再灌注损伤 心肌缺血 细胞凋 兔

　　CARDIOPROTECTIVE EFFECT OF VALSARTAN ON CARDIAC ISCHEMIC-REPERFUSION INJURYNING XIAN-FENG, ZHANG WEN-ZHONG, LIU SONG, et al(Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo study the effects of valsartan postconditioning an angiotensin Ⅱ receptor antagonist on myocardial apoptosis induced by acute myocardial ischemic-reperfusion, and probe into the probable mechanism. MethodsTwenty-four Newzealand rabbits were randomized evenly to three groups: control group, post-C group and medicine interventional (MI) group. All rabbits were subjected a total of 60 minutes of left anterior descending coronary artery occlusion (LADO) and 6 hours of reperfusion. In addition, rabbits in post-C group received 30 mg/kg i.v. of valsartan 15 minutes before reperfusion. MI group received 30 mg/kg i.v. of valsartan and 0.05 mg/kg i.v. of PKC antagonist GF109203X 15 min and 5 min before reperfusion, respectively. After the experiment, the rabbits were sacrificed and myocardium tissue obtained for histology. The changes of myocardium morphology was observed microscopically. TUNEL was applied to monitor the myocardium apoptosis. Bcl-2 and Bax protein expressions were assessed by immunohistochemistry.ResultsCompared with the control and MI, the alteration of myocardium structure in post-C group was very mild and the level of myocardium apoptosis index was reduced significantly (F=4.58;q=3.321,4.001;P<0.01). The Bcl-2 protein was significantly increased (F=7.23;q=4.730,4.580;P<0.01), while the Bax protein was significantly decreased (F=8.35;q=4.684，5.275;P<0.01) in the post-C compared with the other two groups. There was no significant differences in all the index observed between the MI and the control (P>0.05).ConclusionValsartan postconditioning can reduce the myocardium apoptosis and affect the production of Bcl-2 and Bax protein induced by acute myocardial ischemia-reperfusion. Valsartan shows protective effect for ischemic myocardium. The mechanism of protection is probably related to the activation of protein kinase C.

　　[KEY WORDS]Myocardial reperfusion injury; Myocardial ischemia; Apoptosis; Rabbits

　　1986年，MURRY等[1]首先报道了缺血预处理现象，其后有研究表明，缺血预处理可以减轻细胞凋亡程度从而产生心肌保护作用[2]。然而，缺血预处理在临床上推广应用尚有一定的局限性。2003年,ZHAO等[3]研究显示，将犬心的左冠状动脉前降支结扎1 h后,予以重复开通30 s再结扎30 s的连续3次循环,随后恢复冠状动脉血流,其心肌梗死范围较对照组减少44%,与缺血预适应组梗死范围减少的程度相同,同时可显著减轻组织水肿,减少缺血区心肌中性粒细胞的聚集,保护缺血区冠状动脉内皮功能，将此法对缺血再灌注心肌的保护作用命名为缺血后处理。张文忠等[4]认为肾脏缺血后处理能减少心肌酶的释放。本研究旨在研究缬沙坦后处理对急性缺血再灌注心肌组织结构、细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，并探讨其保护机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物和分组 健康新西兰大白兔24只，雌雄不分，体质量2.0～2.5 kg，随机分为3组，每组8只。对照组:结扎左冠状动脉前降支1 h，再灌注6 h;后处理组：结扎左冠状动脉前降支1 h，于再灌注前15 min通过耳缘静脉注射缬沙坦(30 mg/kg)，再灌注6 h;药物干预组：结扎左冠状动脉前降支1 h，于再灌注前15 min通过耳缘静脉注射缬沙坦(30 mg/kg)，再灌注前5 min给予蛋白激酶C抑制剂GF109203X (0.05 mg/kg)耳缘静脉注射并持续5 min，最后心肌再灌注6 h。

　　1.1.2 主要试剂 缬沙坦原粉购自诺华公司，GF109203X购自美国Biomol公司，DAB、SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，一抗Bcl-2、Bax购自武汉博士德生物工程有限公司，In Situ Cell Death Detection Kit购自德国Roche公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 缺血再灌注模型制备 大白兔采用乌拉坦(1 g/kg)耳缘静脉注射麻醉，仰位固定，记录胸前12导联心电图，连接心电监护。除毛，沿胸骨正中偏左0.5 cm切开皮肤，暴露左侧3、4肋骨，钝性分离肋间肌，小弯钳于肋下穿10号缝合线2根，分别结扎，沿结扎线正中剪断3、4根肋软骨，牵拉两侧结扎线，暴露胸腔，分离脂肪组织，可见心包及心脏搏动。提起心包正中，用眼科剪将心包前部剪开,将心包用缝线固定于胸壁，充分暴露心脏。用止血钳将左心耳轻轻提起，观察冠状动脉的走行。以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2 mm处，用持针器持小圆针在冠状动脉前降支根部穿一结扎线，结扎线穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁穿出，在该结扎线下方约0.5 cm处再穿一结扎线，双重结扎左前降支1 h，再灌注6 h。以心电图胸前导联出现ST段弓背向上抬高为结扎成功。

　　1.2.2 取材及标本制备 实验结束即刻处死兔，打开胸腔，切取心脏，放于无菌生理盐水中，立即切取5 mm×5 mm×2 mm的梗死区组织，置于40 g/L中性甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋、切片，用蛋白甘油混合液贴附于载玻片上，脱蜡复水、苏木精-伊红染色，脱水、透明后，用中性树胶封藏，显微镜下观察缺血坏死区心肌组织结构的变化。

　　1.2.3 心肌细胞凋亡指数(AI)的检测 采用Tunel法，严格按照试剂盒说明书操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片随机选择5个视野(400倍)，计数阳性染色的心肌细胞数及心肌细胞总数，计算AI。AI=阳性细胞数/心肌细胞总数×100%。

　　1.2.4 Bcl-2、Bax蛋白表达的检测 将经40 g/L中性甲醛固定24 h的标本常规石蜡包埋、切片，厚度约4.5 μm，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，采用免疫组化SP法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。Bcl-2阳性细胞胞浆及胞膜呈棕褐色,Bax阳性细胞胞浆呈棕褐色。着深棕色者为强阳性表达细胞，不着色者为阴性表达细胞，介于两者之间者为弱阳性表达细胞。每张切片随机选取5个视野(400倍)，采用VIDAS图像分析系统(德国欧波同公司)测定其阳性表达面积、平均吸光度和积分吸光度，计算单位面积平均吸光度。单位面积平均吸光度=[积分吸光度/(512×512)]×100%。

　　1.3 统计学处理

　　实验结果以x±s表示,使用SPSS 12.0软件进行数据处理,多组数据间比较采用方差分析,组间两两比较采用q检验(Studengt Newman-Keuls法)。

　　2 结 果

　　2.1 各组心肌组织结构比较

　　对照组：心肌细胞间质水肿，肌纤维肿胀，排列无序，横纹消失，肌浆内出现空泡变性，可见较多粒细胞灶状浸润，并可见少量红细胞渗漏，个别细胞出现溶解、坏死。后处理组：心肌细胞轻度水肿，界限清楚，细胞排列相对规则，间质无水肿，可见少量中性粒细胞浸润，无红细胞渗漏。药物干预组：心肌细胞水肿，肌纤维部分肿胀，部分细胞溶解，细胞界限欠清楚，部分肌细胞萎缩而致核聚集，横纹消失，间质充血，较多中性粒细胞浸润，可见红细胞渗漏。

　　2.2 各组AI比较

　　后处理组AI为16.29±4.13，明显低于对照组(21.37±4.30)和药物干预组(22.41±4.54)，差异有显著性(F=4.58，q=3.321、4.001，P<0.05),药物干预组与对照组AI比较差异无统计学意义(q=0.680，P>0.05)。

　　2.3 各组心肌细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达的比较

　　后处理组动物Bcl-2阳性表达单位面积平均吸光度明显高于对照组和药物干预组(F=7.23,q=4.730、4.580，P<0.01),药物干预组和对照组相比差异则无统计学意义(q=0.150,P>0.05);后处理组Bax阳性表达单位面积平均吸光度明显低于对照组和药物干预组(F=8.35，q=4.684、5.275，P<0.01)，药物干预组和对照组相比差异则无统计学意义(q=0.591，P>0.05)。见表1。表1 各组心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白单位面积平均吸光度的比较

　　3 讨 论

　　缬沙坦是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，可选择性地与血管紧张素Ⅱ受体结合，阻断血管紧张素Ⅱ引起血管收缩、促进醛固酮分泌等作用，从而降低血压。缬沙坦除降压作用外，对心脏保护作用范围广、疗效确定。

　　心肌组织结构的改变是反映心肌细胞损伤最直观的指标,心肌缺血30～40 min，心肌细胞可发生缺血性损害。光镜下观察可见正常心肌细胞严重肿胀，界限不清，排列紊乱，并见中性粒细胞及红细胞浸润等损伤现象。

　　细胞凋亡是机体的正常细胞在受到生理性或病理性刺激后启动的自发的死亡过程，缺血再灌注损伤可诱发细胞凋亡的发生，细胞凋亡已成为缺血再灌注损伤发病机制中的一个重要环节。已有研究证实，心肌缺血预处理可减少细胞凋亡的发生[5]。

　　大多数细胞在凋亡过程中有新基因的表达和蛋白质的合成,有大量的基因可促进或抑制细胞凋亡的发生。Bcl-2基因是凋亡抑制基因，其过量表达可阻断因缺血、细胞因子短缺、辐射、抗肿瘤药物、c-myc等不同刺激诱发的细胞凋亡。Bcl-2抑制凋亡的机制是直接或间接地阻止细胞色素C自线粒体的释出，而后者可与ATP一起改变Apaf-1的构型而激活caspase-9。Bax基因为促凋亡基因，主要表达于线粒体膜和内质网膜上。Bax与Bcl-2有很高的同源性，能与Bcl-2形成异源二聚体，通过抑制后者的活性，使凋亡易于发生。Bcl-2和Bax的表达决定了细胞命运，Bcl-2占优势时阻止细胞凋亡发生，而Bax占优势时则细胞趋向凋亡。

　　蛋白激酶C(PKC)是心肌细胞磷脂酰肌醇信号转导系统的重要组成部分，PKC在缺血预处理中的重要作用已经得到证实。目前的观点认为，缺血预处理对心肌的保护机制是：一些活性物质如腺苷、缓激肽、阿片等释放后，作用于相应的受体，最后通过诱导PKC这一共同通路，再进一步激活其他激酶使效应器(可能主要是线粒体上的ATP敏感性钾通道)磷酸化，诱导心肌保护机制[6]。

　　本文为了观察缬沙坦后处理对缺血再灌注心肌的保护作用，对缺血再灌注心肌组织结构、细胞凋亡及相关基因Bcl-2、Bax蛋白的表达进行了观察，同时通过应用PKC抑制剂GF109203X，探讨其可能机制。结果显示，各组心肌组织结构均有损伤，但后处理组损伤程度明显低于对照组和药物干预组;各组心肌均有一定的细胞凋亡，而后处理组AI明显低于对照组和药物干预组;后处理组Bcl-2蛋白表达增强，而Bax蛋白表达明显减少。提示缬沙坦后处理可减轻缺血再灌注心肌的损伤，并通过抑制细胞凋亡，上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达而发挥心肌保护作用;而药物干预组和对照组之间各指标相比无显著性差异，说明其保护机制可能与激活PKC有关。

　　【参考文献】

　　[1] MURRY C E, JENNINGS R B, REIMER K A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell in jury in ischemic myocardium[J]. Circulation, 1986,74(5):1124-1136.

　　[2] GOTTLIEB R A, BURLESON K O, KLONER R A, et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyomycytes[J]. J Clin Invest, 1994,94(4):1621-1628.

　　[3] ZHAO Z Q, CORVERA J S, HALKOS M E, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditiong[J]. Am J Physiol, 2003,285:H579-H588.

　　[4] 张文忠,陈文一,刘松,等. 肾脏缺血后处理对家兔缺血再灌注心肌酶的影响[J]. 齐鲁医学杂志, 2007,22(3):204-208.

　　[5] WANG N P, BUNFKIN B L, NAKAMURA M, et al. Ischemic preconditioning reduces neutrophil accumulation and myocardial apoptosis [J]. Ann Thorac Surg, 1997,67:1685-1695.

　　[6] SCHWARTZ L M, LAGRANHA C J. Ischemic postconditioning during reperfusion activates Akt and ERK without protecting against lethal myocardial ischemia-reperfusion injury in pigs[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006,290(3):H1011-1018.