异甜菊醇对大鼠心肌缺血再灌注损伤的心电图影响

　　作者：李莲顺 李永芳 作者单位：(1.青海省乐都县人民医院;2.青海大学医学院)

　　【摘要】 目的 观察异甜菊醇对大鼠心肌缺血再灌注损伤的心电图影响，并探讨它的作用与线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)开放的关系。方法 结扎大鼠冠状动脉30 min，再灌注90 min，造成心肌缺血再灌注损伤模型。结扎前静脉注射异甜菊醇和/或选择mitoKATP关闭剂5-羟基癸酸(5-HD)进行预处理，观察各组大鼠在整个缺血再灌注期间心电图ST段和室性心律失常发生情况。结果 预先给予异甜菊醇0.5、1.0和2.0mg/kg，能有效降低大鼠心肌缺血再灌注损伤引起的ST段变化和室性心律失常的发生率;但此作用可被预先给予的5-HD减弱。结论 异甜菊醇能降低心肌缺血再灌注损伤程度和室性心律失常发生率，其机理可能与mitoKATP的开放有关。

　　【关键词】 异甜菊醇 心肌缺血再灌注损伤 线粒体ATP敏感性钾通道

　　EFFECT OF ISOSTEVIOSIDE ON THE ELECTROCARDIOGRAM

　　INDUCED BY ISCHEMIA AND REPERFUSION IN RAT

　　Li Lianshun1 Li Yongfang2

　　(1.Ledu County People’s Hospital in Qinghai Province ;

　　2.Qinghai University Medical College)

　　Abstract Objective To observe the effect of isostevioside on the electrocardiogram induced by ischemia and reperfusion in rat, and to explore the relationship between the cardioprotective effect of isostevioside and mitochondrial ATP- sensitive channels(mitoKATP ). Methods The myocardial injury was induced by ligation of the left coronary lasting for 30 min followed by relief for 90 min. Isosteviol (0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg, iv) and 5-Hydroxydecanoate (10mg/kg, iv) were administrated 10～15 min prior to ischemia-reperfusion. The changes of ST segment and the incidence of ventricular tachycardia (VT) and ventricular fibrillation (VF) were monitored during experiment. Results　The changes of ST segment and the incidence of VT and VF in rats pretreated with isosteviol were significantly less than ischemia-reperfusion group. In 5-HD+ST-1 group, the changes of ST segment and the incidence of VT and VF were less than those in isosteviol pretreated group. Conclusion Isosteviol has protective effect on myocardial injury and arrhythmia induced by ischemia-reperfusion in rats; it may be mediated by mitoKATP

　　Key words Isosteviol Myocardial ischemia-reperfusion injury Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel

　　心肌缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理变化过程，可引起心功能衰竭、心律失常和心肌细胞死亡。目前许多的研究已证实ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP)开放能有效抑制心肌缺血复灌损伤的作用。mitoKATP通道的活性受多种因素调节, 其中细胞内三磷酸腺苷(ATP)浓度是主要因素之一。在生理情况下mitoKATP通道保持关闭状态。当细胞内ATP水平下降时KATP通道趋向于开放。异甜菊醇(isosteviol, ent-16-ketobeyeran-19-oic acid)是甜菊苷的酸水解产物，研究表明：它能抑制大鼠肝细胞线粒体氧化磷酸化有关酶的活性，减少ATP的合成，有利于开放mitoKATP。且有研究发现异甜菊醇有松弛大鼠血管平滑肌作用,该作用可能也与钾通道开放有关[1]。通过在体大鼠研究，从功能、形态和酶学等方面已证实异甜菊醇具有保护心肌缺血再灌注损伤的作用[2]。本试验旨在观察异甜菊醇对心肌缺血再灌注损伤大鼠的心电图影响，并探讨它的作用与mitoKATP之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　健康成年SD大鼠 ，体重250～350 g，雌雄兼用，购自南京医科大学医学实验动物中心。

　　1.1.2 主要药品及试剂

　　异甜菊醇按Mosetting等[3]报道的方法制备，纯度为99.5%。 使用前用NaOH溶液溶解后，用HCL将溶液pH值调整到7.3～7.5，再用生理盐水稀释到所需浓度。5羟基癸酸(5-Hydroxydecanoate，5-HD )购于Sigma公司，为白色粉末。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物分组

　　根据大鼠体重、性别随机分为模型对照组(IR)、异甜菊醇0.5 mg/kg组(ST1)、1.0 mg/kg组(ST2)、2.0 mg/kg组(ST3)、5羟基癸酸 10 mg/kg组(5-HD)和5羟基癸酸 10 mg/kg +异甜菊醇1.0 mg/kg组(5-HD+ST2),每组10～12只。将各组大鼠心脏冠状动脉结扎30 min后,再灌注90 min。IR 、ST1、ST2和ST3组大鼠在结扎前10 min经颈静脉依次给予生理盐水1ml/kg、异甜菊醇0.5 mg/kg、1 mg/kg、和2.0 mg/kg;5-HD组在结扎前15 min经颈静脉给予5羟基癸酸(10 mg/kg); 5-HD+ST2组在结扎前15 min经颈静脉给予5-HD (10 mg/kg), 5 min后给予异甜菊醇(1.0 mg/kg)。给药体积均为1.0 ml/kg。

　　1.2.2 模型的制备及心电图的测定

　　按照文献[4]，腹腔注射乌拉坦(1 g/kg)麻醉大鼠。切开颈部皮肤，气管内插管,插管接人工呼吸机，呼吸频率55～65次，潮气量1.5～2.0 ml/100 g，呼∶吸比为1.5∶1，压力在5～15 cmH2O之间。根据呼吸频率、深度调整呼吸参数。将针式电极固定于大鼠四肢皮下监测其肢体Ⅱ导联心电图的变化。沿胸骨左缘剪开3、4、5肋骨，暴露心脏，剪开心包膜。以左冠状动脉为标志，用3/8圆3×10不锈钢圆针在左冠状动脉下穿一丝线(3-0)。进针深度以穿过心肌1.0 mm左右为准，进出针间宽度：动脉两边1.5～2.0 mm。稳定15 min后记录药前心电图。将一细小乳胶管垫于血管与结扎线之间，拉紧结扎线使细小乳胶管压迫左冠状动脉而致闭塞。以结扎后心脏局部发绀伴随T波高耸或ST段抬高作为结扎成功的标志。结扎30 min后，松开结扎线，再灌注90 min，以局部发绀逐渐变为红润、心电图ST段逐渐恢复为再灌注成功的标志。在整个缺血再灌注期，记录肢体Ⅱ导联心电图的变化。

　　1.3 统计学处理方法

　　用SAS 6.1统计软件处理所有数据。计量资料实验结果用x±S表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD-t检验。计数资料用四格表确切概率法检验,以P<0. 05为有显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠心肌缺血再灌注后心电图ST 段的变化情况

　　缺血再灌注前分别给予异甜菊醇0.5 mg/kg、1.0 mg/kg和2.0 mg/kg行预处理,其ST段变化均低于IR组各时间对应值(P<0. 05或P<0. 01),说明异甜菊醇预处理能降低大鼠心肌缺血再灌注损伤。单纯5-HD预处理对大鼠心肌缺血再灌注后ST段无影响。5-HD+ST2组其ST段明显高于ST2组，但低于5-HD组,说明5-HD 能部分削弱异甜菊醇(1.0 mg/kg)对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用，结果详见表1。表1各组大鼠心肌缺血再灌注后心电图ST 段的变化情况

　　2.2 各组大鼠心肌缺血再灌注后室性心律失常的发生率情况

　　IR组在心脏缺血及再灌注期间出现频发的室性心律失常。缺血前给异甜菊醇可剂量依赖性减少室性心律失常的发生。单纯5-HD预处理对缺血再灌注大鼠室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)的发生没有影响。与IR组无显著性差异(P>0.05)。5-HD+ST2组室性心律失常(VT，VF)的发生率高于ST2组，但组间无差异，可能与例数少有关，结果详见表2。表2各组大鼠心肌缺血再灌注后VT和VF的发生率 注：与IR组比，* P<0.05 ，** P<0.01.

　　3 讨论

　　现在认为，引起心肌缺血再灌注损伤最主要的原因是细胞内酸中毒、Ca2+超载和氧自由基增多。细胞内Ca2+超载，尤其线粒体Ca2+超载，使细胞内ATP合成下降 [5，6]。氧自由基有很高的化学活性，可引起非饱和脂肪酸和磷脂过氧化，引起线粒体和细胞膜毁损，导致细胞凋亡和坏死。有许多研究表明：mitoKATP开放可通过诱导线粒体膜除极化，释放蓄积的钙离子[7];加快呼吸链电子转运，增加线粒体内侧的基质氧化状态， Ca2+内流减少，肌动蛋白ATP的能量消耗减少 [8]， 有效抑制心肌缺血再灌注损伤的作用。心肌缺血再灌注损伤性心律失常的机制较为复杂，可能与多个因素有关，如心肌细胞的电生理改变;β2肾上腺素受体兴奋;自由基水平升高，细胞膜损伤等[9]。

　　本实验结果显示,预先给予异甜菊醇0.5、1.0和2.0mg/kg，能有效降低大鼠心肌缺血再灌注损伤引起的ST段变化和室性心律失常的发生率,提示异甜菊醇具有保护大鼠心肌缺血再灌注损伤作用，并且抑制室性心律失常的发生。此结果与文献[2]结果一致。实验还表明,选择性线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-HD,可以削弱异甜菊醇对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。提示异甜菊醇抗大鼠心肌缺血再灌注损伤作用与mitoKATP开放有关，但5-HD不能完全消除异甜菊醇抗大鼠心肌缺血再灌注损伤作用，因此mitoKATP开放不是异甜菊醇抗大鼠心肌缺血再灌注损伤作用的惟一途径;5-HD对其抗心律失常作用也有减弱趋势，但没有统计学意义。这可能与本实验样本少有关，或异甜菊醇通过其他机制发挥抗心律失常作用，如氧自由基生成减少,纠正细胞的电生理紊乱等，详细机制还有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Wong KL, Chan P, Yang HY, et al. Isosteviol acts on potassium channels to relax isolated aortic strips of Wistar rat[J].Life Sci, 2004,74(19):2379-2387

　　[2] 李永芳,许德义.异甜菊醇对大鼠在体心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2005，19(5):343-346

　　[3]Mosettig E, Nes WR. SteviosideⅡ-the structure of the agucon[J].J Org Chem, 1955,20:884-899

　　[4]Ockaili RA, Bhargava P, Kukreja KC. Chemical preconditioning with 3-nitropropionic acid in hearts role of mitochondrial K(ATP) channel[J].Am J Physiol heart Circ Physiol, 2001,280(5): 406

　　[5] Cryer HG. Therapeutic approaches for clinical ischemia and reperfusion injury[J]. Shock, 1997, 8:26-32

　　[6] Miyata H, Lakatta EG, Stern MD, et al. Relation of mitochondrial and cytosolic free calcium to cardiac myocyte recovery after exposure to anxia[J]. Circ Res, 1992,71:605-613

　　[7] Holmuhamedov EL，Jovanovic S, Dzeja PP, et al. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channels modulate cardiac mitochondrial function[J]. Am J Physiol, 1998,275(5 Pt 2):H1567-1576

　　[8] Carroll R, Walker JM, Yellon DM. Myocardial protection :The role of the K+ATP channel[J]. J Clin Basic Cardiol, 1999,2:8-11

　　[9] 陈新主编.临床心律失常学(第二版).北京:人民卫生出版社,2000.98-104