美托洛尔对大鼠缺血心肌血管新生及血管内皮生长因子表达的影响

　　作者：张蕊, 刘兴德 作者单位：贵阳医学院附院 心内科， 贵州 贵阳 550004

　　【摘要】 目的： 观察美托洛尔对大鼠缺血心肌血管新生和缺血心肌血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法： 运用大鼠心肌缺血模型，随机分为给药组和模型组，并记录心率。用免疫组织化学方法检测缺血心肌中内皮细胞数、毛细血管密度、VEGF蛋白质的表达，用RT-PCR方法检测VEGF mRNA的表达。结果： (1)与模型组比较，给药组大鼠缺血心肌毛细血管密度和内皮细胞数均明显增加(P<0.01)，其心率明显降低(P<0.01);(2)与模型组比较，给药组大鼠缺血心肌VEGF蛋白质及mRNA的表达均明显增加(P<0.01)。结论： (1)美托洛尔能促进大鼠缺血心肌的血管新生;(2)美托洛尔减慢心肌缺血大鼠的心率和上调VEGF的表达可能是其促大鼠缺血心肌血管新生的机制之一。

　　【关键词】 冠状动脉疾病; 心肌缺血; 大鼠，Wister; 血管新生; 美托洛尔; 血管内皮生长因子

　　The Effects of Metoprolol on Angiogenesis and Expresssion

　　of VEGF in Ischemic Myocardium of Rats

　　ZHANG Rui, LIU Xingde

　　(Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To observe the effects of metoprolol on angiogenesis and expresssion of vascular endothelial growth factor (VEGF) in ischemic myocardium of rats. Methods: Thirty-six rats with myocardium infarction were divided randomly into metoprolol group (group A, treated with metoprolol,n=18) and model group (goup B, rats with ischemic myocardium but did not receive treatment,n=18), and their heart rates were recorded. Endothelial cells (EC), capillary density (CD), and VEGF protein expression were detected with immunohistochemical method, while RT-PCR method was adopted for the assay of VEGF mRNA. Results: (1) EC and CD of rats in group A were significantly higher than those of rats in group B(P<0.01); and the heart rate of rats in group A was obviously lower than that in group B(P<0.01). (2) The protein expression and mRNA expression of VEGF were significantly higher in ischemic myocardium of group A than those of group B(P<0.01). Conclusions: Metoprolol may promote angiogenesis in ischemic myocardium of rats. One of the mechanisms might be that Metoprolol can decrease the heart rate and increase the expression of VEGF.

　　[Key words] coronary disease; myocardial ischemia; rats,Wister; angiogenesis; metoprolol; vascular endothelial growth factor

　　冠心病是临床常见疾病，除药物保守治疗外，经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术等血管重建措施治疗冠心病已取得满意效果,但这些方法主要靠侵入恢复冠状动脉血流，且存在费用高昂、手术复杂、有危险性以及术后再狭窄等问题。随着人们对冠心病研究的深入,发现某些药物能诱导缺血心肌血管新生。有学者报道，三七总皂苷、川芎嗪注射液、丹参注射液、葛根素注射液有促心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生的作用，此为当前缺血性心脏病的治疗研究提供了一个重要方向[1]。目前，作为临床治疗冠心病的常用药物β受体阻滞剂是否具有促进缺血心肌血管新生的功能，文献报道很少[2]。2005年9月～2006年10月对临床常用β受体阻滞剂——美托洛尔对大鼠缺血心肌血管新生及缺血心肌VEGF表达的影响进行观察,为寻找促进冠心病患者缺血心肌血管新生的药物及治疗措施提供基础研究资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　Wistar大鼠36只，雌雄不拘，体重200～300 g，由贵阳医学院实验动物中心提供。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　VEGF兔多克隆抗体(博士德)，Ⅷ因子相关抗原抗体(博士德)，即用型免疫组织化学试剂盒(博士德)，DAB(博士德)，美托洛尔(阿斯利康)，Trizol(上海生工)，Taq酶(天根)，DNTP(上海生工)，DEPC(广东瑞兴)，MMLV第一链cDNA合成试剂盒(MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit，上海生工)，Marker(上海生工)，DHG30动物人工呼吸机(浙江大学仪器厂)，ULT-1386-3三洋-86 ℃低温冰箱(日本)，5745台式冷冻离心机(德国)，Biomias 99纤维采集图像分析系统(四川大学图像图形研究所)，Eppendorff centrifuge 5810 R 高速离心机，Amersham核酸蛋白分析仪。

　　1.3 引物

　　参照文献设计VEGF及对照引物，由上海生工合成。

　　上游引物序列：5’-CCATGAACTTTCTGCTCTCTTG-3’

　　下游引物序列：5’-GGTGAGAGGTCTAGTTCCCGA-3’

　　内参

　　上游引物序列：5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’

　　下游引物序列：5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’

　　1.4 大鼠心肌梗死模型的制作

　　10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，呼吸机辅助呼吸(呼吸频率60次/min，潮气量4～6 ml)，开胸，由胸骨中线开始，沿左侧第4肋间作一长约2.0 cm的横切口，钝性分离胸壁肌层、肋间肌，作简易荷包缝合备用，分离至胸膜腔，打开心包后于左心耳和肺动脉根部之间结扎冠状动脉左前降支，随后拉紧荷包，缝合胸壁肌层及皮肤，关闭胸腔。以心电图肢导联ST段弓背向上抬高持续30 min以上作为梗死模型复制成功的标志。以上手术均在严格无菌条件下进行，术后伤口处滴青霉素钠，连续3 d每天腹腔注射青霉素钠8万单位抗感染。

　　1.5 分组与用药

　　大鼠心肌梗死稳定1周后，随机分为给药组(A组)和模型组(B组)。A组进一步分为三组：A1～A3组(每组6只)，给予美托洛尔(每天50 mg/kg[3])灌胃，依次于给药1周、2周、3周处死，取材。B组进一步分为三组： B1～B3组(每组6只)，给予生理盐水灌胃，依次于给药1周、2周、3周处死，取材。各组大鼠均活杀后取左室梗死及相邻部位心肌放入10%甲醛溶液中保存备检。

　　1.6 大鼠心率(HR)的测定

　　将大鼠用水合氯醛麻醉后，用心电图仪分别于用药后1周、2周、3周对大鼠行心电图检查，记录心率。

　　1.7 缺血心肌组织中内皮细胞及毛细血管密度的检测与计数

　　取10%甲醛固定之梗死周边缺血区心肌组织，并进行常规石蜡包埋及作心肌切片(5 μm)。按SP试剂盒说明，以Ⅷ因子相关抗原抗体作内皮细胞免疫组织化学染色。内皮细胞胞浆呈棕黄色。在400倍视野下计数内皮细胞(EC) ,取5个连续缺血区域视野下的均值，同时计数毛细血管(直径< 20 μm)，以毛细血管数/mm2表示毛细血管密度(CD)。

　　1.8 大鼠缺血心肌中VEGF蛋白质表达的检测

　　运用免疫组织化学方法,严格按SP试剂盒说明操作。细胞胞浆颜色呈棕黄色染色为阳性。采用高清晰度彩色病理图像测量系统,在400倍视野下测定平均光密度值并作半定量分析。

　　1.9 大鼠缺血心肌中VEGF mRNA表达检测

　　用RT-PCR的方法检测。能扩增610 bp为阳性。

　　1.10 统计学分析

　　所有数据以x±s表示，多组间比较采用方差分析，q检验。所有数据均在SPSS软件上处理，P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 美托洛尔对大鼠缺血心肌CD、EC及HR的影响

　　由表1可见，A1组与B1组比较、A2组与B2组比较、A3组与B3组比较，前者的缺血心肌毛细血管密度和内皮细胞数均明显增加(P<0.01)，而心率则明显降低(P<0.01);与A1组比较，A2组与A3组的缺血心肌毛细血管密度和内皮细胞数均显著增加(P<0.01)，而心率明显降低(P<0.01);A2组与A3组的相应指标比较差异均无显著性。

　　2.2 美托洛尔对大鼠缺血心肌VEGF表达的影响

　　由表2可见，A1组与B1组比较、A2组与B2组比较、A3组与B3组比较，前者的缺血心肌VEGF mRNA及蛋白质的表达均明显增加(P<0.01);与A1组比较，A2组与A3组的VEGF mRNA及蛋白质表达均明显增加(P<0.01);A2组与A3组相应指标间比较差异无显著性。表1 美托洛尔对大鼠缺血心肌CD、EC、HR的影响 (1)与同一时间段B组比较,P<0.01;(2)与A1组比较, P<0.01表2 美托洛尔对大鼠缺血心肌VEGF表达的影响(1)与同一时间段B组比较, P<0.01;(2)与A1组比较, P<0.01

　　3 讨论

　　心脏冠状动脉侧支循环的形成和开放能够减轻心肌缺血，防止细胞坏死，预防和延缓缺血性心肌病的形成，改善病人的临床症状和预后。血管新生可促进缺血周边组织侧支循环建立。有研究发现某些药物能诱导缺血心肌的血管新生[1，2]。因此，积极寻找具有促进缺血心肌血管新生的临床常用药物对缺血性心脏病治疗具有实用价值。

　　美托洛尔是目前临床治疗冠心病的常用药物，可减慢心率、抑制心肌收缩力、降低心肌耗氧量，已证实其能够减少缺血性心脏病患者再梗死率、恶性心律失常及猝死的发生，长期应用可降低冠心病患者病死率。

　　本研究显示，与模型组比较，给药组大鼠缺血心肌毛细血管密度与内皮细胞数均明显增加，提示美托洛尔能促进大鼠缺血心肌的血管新生。

　　本研究同时显示，给药组大鼠缺血心肌毛细血管密度和内皮细胞数在用药2周时较1周明显增加，而用药3周与2周相比无明显变化。提示美托洛尔应用2周时可达到最大促大鼠缺血心肌血管新生的效能，推测在临床上急性心肌缺血患者在长期服用美托洛尔后出现的对冠心病患者的心肌保护效应部分可能与缺血心肌的血管新生有关，但具体需要多长时间能够形成有功能的新生血管，尚需进一步研究。

　　研究发现在某些病理状态下血管新生机制可被激活，但血管新生的机制复杂[4]。文献报道，用心得安、alinidine减慢心率，或用缓慢心房起搏等方法构建心动过缓实验动物模型，结果显示可明显促进心肌血管新生[5～7] 。近来有学者报道，VEGF定向转染能诱导缺血心肌的血管形成[8]。本研究显示给药组大鼠的心率显著降低，并且与同时间段模型组比较，给药组大鼠缺血心肌VEGF mRNA及蛋白质的表达均明显增加，且给药组大鼠缺血心肌VEGF mRNA及蛋白质表达2周较1周明显增加，3周与2周比较差异无显著性。表明美托洛尔促大鼠缺血心肌血管新生效能与促VEGF的表达相一致，提示美托洛尔可能通过减慢心肌缺血大鼠的心率和上调VEGF的表达促大鼠缺血心肌血管新生。但美托洛尔上调大鼠心肌中VEGF表达后，通过怎样的机制最终促进大鼠缺血心肌血管的新生有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 王振涛,韩丽华,朱明军,等. 黄酮、皂苷类中药对促心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生作用及相关生长因子表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2006

　　(4):305-307.

　　[2] 佘强, 陈运贞. β受体阻滞剂促大鼠缺血心肌血管新生的实验研究[J].重庆医科大学学报,2001(2):146-150.

　　[3] 徐叔云,卞如廉,陈修.药理实验方法学.3版[M].北京:人民出版社,2003:202.

　　[4] Schaper W, Ito WD. Molecular mechanisms of coronary collateral vessel growth[J], Circ Res, 1996(5):911-919.

　　[5] Bronn MD, Davies MK, Hudlicka O. The effect of long-term bradycardia on heart microvascular supply and performance[J].Cell Mol Bio Re,1994(2):137-142.

　　[6] Zheng W, Brown MD, Brock TA, et al. Bradycardia induced coronary angiogenesis is dependent on vascular endothelial growth factor[J].Cir Res,1999(2):192-198.

　　[7] Lei L, Zhou RF, Zheng W, et al. Bradycardia induces angiogenesis,increases coronary reserve, and preserves function of the postinfarcted heart[J].Circulation,1999(7):796-802.

　　[8] 王志维,张凯伦,高尚志,等.血管内皮生长因子定向转染诱导缺血心肌血管形成的研究[J].中华实验外科杂志,2006(7):844-846.