Apelin对两肾一夹高血压大鼠离体主动脉环的舒张作用

　　作者：庄红，金戈，陈磊，杨鹏麟 作者单位：温州医学院第二附属医院 心血管内科，浙江 温州 325027

　　【摘要】 目的: 探讨小分子活性肽Apelin-13对两肾一夹(2K1C)高血压大鼠离体主动脉环的舒张作用及意义。方法: ①清洁级雄性SD大鼠27只，随机分为正常对照组和2K1C高血压模型组。测定平均颈动脉压(mCAP)、左心重与体重比值(LVM/BW)以及右肾重/左肾重(RK/LK)，以评价2K1C模型。②采用累计加药法，观察Apelin-13分别对用去甲肾上腺素(NE)预收缩的对照组大鼠和2K1C高血压组大鼠离体胸主动脉环张力的作用。结果: ①模型组大鼠mCAP、LVM/BW和RK/LK分别较对照组高50.38%(P <0.01)、32.16%(P <0.01)和 51.02%(P <0.01)。②Apelin-13在(10-11～10-7)mol·L-1浓度范围内对内皮完整的两组大鼠胸主动脉环具有浓度依赖性的舒张作用，且模型组舒张率高于对照组 (P <0.05)，而模型组与对照组EC50相比差异无显著性(P >0.05)。结论: Apelin-13具有显著的舒张主动脉的作用，并且对高血压大鼠血管环的舒张作用更强，提示Apelin-13在血管的保护作用中扮演了重要角色。

　　【关键词】 Apelin;主动脉;舒张作用;两肾一夹;高血压;肾性

　　Effect of apelin-13 on vasodilatation of isolated thoracic aorta in rats of one-clip renal hypertension ZHUANG Hong，JIN Ge，CHEN Lei，YANG Peng-lin. Department of Cardiovascular Internal Medicine，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325027

　　Abstract: Objective: To investigate the effect of apelin on vasodilatation of isolated thoracic aorta rings in rats of two Kindey one-clip renal hypertension and its significance. Methods: ①Twenty-seven male Sprague-Dawley(SD)rats with weight of 150～180 g were randomly divided into two groups，control rats(n =12) was estimated and model rats of two Kindey one-clip (2K1C) renal hypertension (n =15). Then，the model of 2K1C renal hypertension by monitoring the mean carotid arterial pressure (mCAP)， measuring the ratio of left ventricular mass (left ventricle plus septum) to bodyweight (LVM/BW)， and right kidney to the left (RK/LK). ②Isolated aorta rings were perfused and were given the resting tension. Then，the effects of accumulated Apelin-13 on aorta rings with endothelium in pre-constricted with norepinephrine (NE) were observed. Results: ①The mCAP and LVM/BW of 2K1C group were 50.38% and 32.16% higher than those of the control group， respectively (P <0.01， P <0.01). And the ratio of RK/LK in the 2K1C group was 51.02% higher than that in the control group (P <0.01). ②Apelin-13 was a potent vasodilatator on rat thoracic aorta. Apelin-13 at 10-11～10-7 mol·L-1 caused dose-depenent vasodilatation in endothelium intact rings pre-constricted with NE. Response of arteries from renal hypertension rats was increased (P <0.05). But the values of EC50 were not significantly different (P >0.05). Conclusion: These results indicate that apelin-13 relaxes the thoracic aorta in the two groups and the response of vasodilatation is enhanced in the rat thoracic aortas from the 2K1C hypertension group. It may be an important protecting factor and play an important role in the protection of blood vessel.

　　Key words: Apelin-13;aorta;vasodilatation;two-kidney and one-clip;hypertension;Renal

　　Apelin是从牛胃分泌物中提取并纯化出的新的小分子活性肽，为G蛋白耦联受体——血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1, APJ )的天然配体[1,2]。Apelin及其APJ在体内分布广泛，以内分泌、旁/自分泌的方式调节心血管系统稳态，具有扩张血管、降低血压和增强心肌收缩力的效应及利尿等生物学作用[3-12]。动物实验发现Apelin能显著降低大鼠平均动脉压，而不引起心率的变化[8];且SHR大鼠对Apelin 的降压作用更敏感[7]。本实验旨在通过观察Apelin-13对离体大鼠主动脉环张力的影响，探讨Apelin-13对血管作用，并且通过观察Apelin-13对两肾一夹高血压大鼠离体胸主动脉环张力的变化，初步探Apelin-APJ系统在肾性高血压发生发展中可能的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 药品与试剂 Apelin-13 购自美国Phoenix Pharmaceuticals Inc;乙酰胆碱( acetylcholine， ACh)购自Sigma公司;去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)购自上海禾丰制药有限公司，产品批号：6A11005。Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol·L-1)：含NaCl 120，KCl 5.5，MgCl2·6H2O 1.2，CaCl2 2.5，NaH2PO4 1.2，NaHCO3 20，EDTA-Na2 0.03，Dextrose 10，pH 7.2～7.4。

　　1.2 实验动物分组及模型复制 本实验采用健康雄性SD大鼠27只，体重150～180 g(由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2003-0003)。大鼠适应新环境2 d后，将大鼠随机分为两组：正常对照组(n =12)及两肾一夹肾性高血压模型组(n =15)。

　　1.2.1 模型组大鼠[13,14]：术前禁食过夜，自由饮水，用戊巴比妥钠(35 mg/kg，ip.)麻醉，上腹部正中切口，沿腹白线逐层分离，暴露肾脏及肾动静脉，玻璃分针分离动静脉，用银夹将肾动脉套住，并打结固定，术后正常进食与喂水。

　　1.2.2 对照组大鼠：仅开腹但不行肾动脉狭窄术，术后给予正常进食及喂水。

　　1.3 大鼠平均颈动脉压及(LV+S)/BW和RK/LK的测定 大鼠饲养8周后，用戊巴比妥钠(35 mg/kg BW，ip.)麻醉，称重，左颈总动脉插管连接Powerlab生理记录仪，记录平均颈动脉压(mCAP)。放血处死动物，迅速剪开胸腔和腹腔，取出心脏、两侧肾脏。剪去右心房组织，沿室间隔边缘剪下右心室，然后称取左心室加室间隔(LV+S，LVM)的重量，并计算出(LV+S)/BW;两侧肾脏去包膜后分别称左肾(LK)及右肾(RK)重量，并计算出RK/LK。

　　1.4 胸主动脉环的制备与稳定 大鼠用戊巴比妥钠(35 mg/kg，ip.)麻醉，左颈总动脉插管放血处死动物，迅速取胸主动脉，置于通以95% O2+5% CO2混合气体的K璈液中。小心去除周围结缔组织后将血管剪成约3～4 mm宽的血管环。避免过度牵拉，以保护内皮的完整。然后，将血管环放入含Kreb’s液的浴槽内，持续通以95% O2+5% CO2的混合气体，将静息张力调至2 g。在37 ℃下稳定90 min，期间每15 min换液一次。

　　血管内皮的完整性用ACh检验。待血管稳定后换液一次，再向浴槽中加入1μmol·L-1的NE使血管收缩，收缩达到峰值后稳定15 min，然后加入10μmol·L-1的Ach观察能否引起血管舒张，若使预收缩的血管环舒张60%～80%则可认为内皮完整;如不产生舒张或舒张幅度小于10%，则视为内皮不完整，弃之。

　　以NE(1μmol·L-1) 诱发最大收缩幅度为100%，以加入药物后的血管张力幅度与NE诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。

　　1.5 Apelin-13对两组大鼠离体主动脉环的舒张效应的观察 对照组和模型组血管环均分别在2 g最适静息张力下平衡90 min后，向浴槽内加入最终浓度为1μmol·L-1 NE预收缩血管，待血管收缩稳定后，向浴槽内依次加入最终浓度分别为10-11、10-10、10-9、10-8、10-7 mol·L-1 Apelin-13，记录血管的张力变化。

　　1.6 统计学处理方法 用不同浓度下的血管收缩值制备剂量-效应曲线，在每次实验中分别计算舒张百分数，半数有效浓度(EC50)值用Scatchar法将浓度-效应曲线转化为直线后通过回归运算求得。数据用SPSS 11.5统计学软件进行统计学处理，两组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 两肾一夹肾性高血压大鼠模型指标(mCAP、LVM/BW) 模型组大鼠mCAP较对照组高50.38%(P <0.01)，LVM/BW较对照组高32.16%(P <0.01)，RK/LK较对照组高51.02%(P <0.01)。见表1。

　　2.2 Apelin-13对NE预收缩的主动脉环张力的影响

　　2.2.1 Apelin-13对对照组主动脉环张力的效应：

　　在10-11~10-7mol·L-1的浓度范围内Apelin-13对内皮完整的对照组离体大鼠胸主动脉环有舒张作用，其舒张作用随着浓度的增大而显著增强(P<0.01)，且在Apelin-13在浓度为10-7mol/L时，对预收缩的胸主动脉环的最大舒张率Emax=(44.43±11.1)%，EC50=(0.39±0.21)。见表2与图1。

　　2.2.2 Apelin-13对模型组主动脉环张力的效应：

　　在10-11~10-7mol·L-1的浓度范围内Apelin-13对内皮完整的模型组离体大鼠胸主动脉环有舒张作用，其舒张作用随着浓度的增大而显著增强(P <0.01)，且在Apelin-13在浓度为10-7mol/L时对预收缩的胸主动脉环的舒张率Emax=(50.81±14.60)%，EC50=(0.35±0.23)。见表2与图1。

　　2.2.3 Apelin-13对两组主动脉环张力的效应比较：在10-11~10-7mol·L-1的浓度范围内Apelin-13对模型组与对照组离体大鼠胸主动脉环都具有舒张作用，模型组中Apelin-13对胸主动脉环的舒张作用强于对照组中Apelin-13对胸主动脉环的舒张作用(P <0.05)，EC50差异没有显著性(P >0.05)。见表2与图1。

　　3 讨论

　　高血压病是以体循环动脉压增高为主要表现的临床综合征，发病机制十分复杂。国内外研究发现高血压的形成、发生发展及病理生理变化与许多机体内小分子活性物质如血管紧张素、尾加压素Ⅱ(UⅡ)、Apelin、motilin、神经介素U及肾上腺髓质素等有关。

　　本实验采用经典的肾素依赖性高血压动物模型，即两肾一夹高血压大鼠模型，也是国际上筛选降压药物最常用的动物模型[13,14]。由于一侧肾动脉的机械性狭窄，导致肾脏灌流不足，激活体内的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)，引起血压升高。本研究结果表明，模型组大鼠颈动脉平均压(mCAP)、左心重与体重比(LVM/BW)、右肾重与左肾重比(RK/LK)均显著高于正常组，说明高血压模型已建立成功。

　　本实验发现，Apelin-13是大鼠离体胸主动脉环的有效血管舒张剂，并且随着Apelin-13的浓度增加，其对血管的舒张作用增强。说明Apelin-13呈浓度依赖性舒张血管，具有扩张血管降低血压作用，这与先前在体给予大鼠静脉注射Apelin-13引起的降压作用的结果一致[7,9,10]。

　　Lee等[7]研究中发现SHR大鼠对Apelin-13的降压作用更敏感，同样浓度的Apelin对SHR大鼠的血压降低程度是正常血压大鼠的2倍。在本实验中也发现Apelin-13对模型组离体主动脉环的舒张作用强于正常对照组的舒张作用(P<0.05，见图1)，虽然Apelin-13对模型组血管环的舒张作用仅比对照组高13.6%，但是有统计学意义。在我们前期的实验研究中发现在两肾一夹的高血压的大鼠血浆中的Apelin的浓度显著高于正常组，在心脏冠脉及肾脏的血管内皮上的APJ受体表达较正常大鼠增加，故可推测在肾性高血压大鼠血管内皮包括大动脉内皮上APJ表达亦增加。而在本实验中两组EC50比较(P>0.05)，差异无显著性，说明在同一半数有效浓度的Apelin-13作用于血管内皮时由于APJ受体增多而使Apelin-13与APJ的结合增多、亲和力增强，从而使Apelin对血管的舒张作用增强。故本实验结果说明Apelin通过对模型组大鼠血管环更强的舒张作用，从而起到对肾性高血压大鼠更有效的降压作用，而实现对血管的保护作用。

　　与Lee等[7]研究的Apelin对SHR大鼠降压作用是正常血压大鼠的2倍的结果相比，本实验仅得出Apelin对2K1C大鼠的降压作用是正常大鼠的1.136倍。这个差异考虑可能为：首先，Lee等[7]的研究是在活体大鼠注射Apelin-13观察其降压作用，而在活体其降压作用可通过神经、体液调节及其他体内活性物质共同完成复杂的过程;而本实验是在离体血管环中，去除了神经、体液以及其他活性物质等调节的作用，仅有Apelin-13对血管的舒张作用。其次，两实验模型的高血压形成的机制不同。SHR是由于过度表达高血压基因或者抗高血压基因的缺失所致原发性血压升高，其体内的舒血管因子(EDRF)和缩血管因子(EDCF)基本还是维持在一个正常的水平，但Apelin基因表达下调，而APJ基因没有改变[8]。而本实验模型是在不改变基因表达的前提下，人为造成血浆中缩血管因子(包括AngⅡ和肾素)的增多，打破了EDRF与EDCF之间的平衡，而在我们前期的研究中发现作为EDRF的Apelin的受体APJ的基因表达和蛋白表达上调，造成Apelin-13对APJ的结合率增加，从而增强对血管舒张作用以对抗EDCF对血管的收缩作用。

　　综上所述，本实验通过观察Apelin-13对离体大鼠主动脉环张力的影响，提示在离体水平Apelin-13的有浓度依赖性的舒张血管、降低血压的作用;并且发现Apelin-13对两肾一夹高血压大鼠离体胸主动脉环舒张作用更强，初步探讨了Apelin-APJ系统在肾性高血压发生发展扮演的重要的保护作用。但是Apelin通过何种具体降压机制尚未清楚，有待于进一步研究。

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