大鼠FXYD5基因的克隆及重组腺病毒载体的构建

　　作者：李小旺 作者单位：温州医学院第一附属医院 心血管内科

　　【摘要】 目的:克隆大鼠离子通道相关蛋白(FXYD5)基因全长cDNA，构建携带FXYD5基因的重组腺病毒载体，为进一步研究其在自发性高血压大鼠(SHR)中的功能作准备。方法:采用cDNA末端快速扩增的方法获得全长cDNA，并插入到载体pGEM-T Easy中测序分析。将FXYD5基因cDNA克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中，随后在BJ5183 细菌中与骨架载体AdEasy-1同源重组。筛选阳性克隆，酶切、测序鉴定正确后，重组载体磷酸钙-DNA共沉淀法转染AD293细胞，获得携带FXYD5基因的重组腺病毒。结果:大鼠FXYD5基因全长cDNA被成功地克隆;FXYD5重组腺病毒载体被成功地构建。结论:运用细菌内同源重组的方法可以在大肠杆菌中快速高效地构建腺病毒载体;FXYD5重组腺病毒载体的成功构建为探讨FXYD5的生物学功能奠定了基础。

　　【关键词】 FXYD5 腺病毒 基因

　　Cloning of rat FXYD5 gene and construction of recombinant adenoviral vector LI Xiao-wang，FANG Fei，SHI Xiang-xiang，HUANG Xiao-yan，ZHANG Huai-qin，YANG De-ye. Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical college，Institute for Cardiovascular Biology and Gene of Wenzhou Medical college，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To clone rat FXYD5 gene full-length cDNA and construct its recombinant adenoviral vector for its function study in SHR. Methods: FXYD5 gene full-length cDNA was amplified using rapid amplification of cDNA end(RACE) method and inserted into pGEM-T Easy vector and confirmed by sequence analysis. The cDNA was cloned into the shuttle vector pAdTrack-CMV. Then the resultant vector was recombinated with pAdEasy-l backbone vector in BJ5183 cells. The positive clones were selected. Finally， the recombinant vector was transfected into AD293 cells by calcium phosphate method of DNA transfection. Results:The full length cDNA of FXYD5 was cloned，and its recombinant adenoviral vector was constructed successfully. Conclusion:The results indicate that the recombinant adenoviral vector can be constructed quickly and efficiently in E.coli with homologous recombination protocol. A recombinant adenovirus Ad-FXYD5 are successfully constructed. The adenovirus will be used to investigate the biologic role of FXYD5 in hypertension.

　　Key words: FXYD5; adenovirus; gene

　　FXYD5属于FXYD家族单跨膜I型膜蛋白。既往研究发现，FXYD5在某些肿瘤细胞中有大量表达，能下调E-钙粘素和促进肿瘤转移[1]。近来Lubarski 等[2]发现，FXYD5多表达在肾脏皮质、十二指肠、脾脏和肺脏，在肾脏主要分布于肾小球集合管基底膜、集合管、集合管的暗细胞，并发现FXYD5和FXYD家族的其他5个成员(FXYD1～4，FXYD7)一样能调节Na+-K+-ATPase活性，FXYD5和Na+-K+-ATPase alpha1和beta1亚单位共表达可使钠泵活性增加2倍。FXYD5与Na+-K+-ATPase作用机制目前仍不清楚。而多项研究均证实Na+-K+-ATPase上确实存在调节血压的位点，并与人和鼠的高血压密切相关[3,4]。本实验室通过基因芯片筛查，发现该基因的表达水平在自发性高血压大鼠(SHR)组比Wistar大鼠(WKY)组下调14.8倍[5]。为了进一步明确FXYD5基因与高血压形成、发展的关系，本实验室构建了携带该基因的腺病毒载体，为探讨FXYD5在高血压形成发展中的生物学功能作准备。

　　1 材料和方法

　　1.1 质粒、菌株和主要试剂 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit、高保真酶购自TAKARA公司。pGEM-T Easy载体购自Promega公司。限制性内切酶均购自NEB公司。pAdTrack-CMV、AdEasier-1 cell(含有骨架载体pAdEasy-1的BJ5183菌株)由TongChuan He、Bert Vogelstein教授惠赠。DH5α、pBluescript II KS(+/-)载体由本科实验室保存。质粒抽提试剂盒均购自Omega公司。MBS Mammalian Tranfection Kit购自Stratagene公司。DMEM 培养基及胎牛血清购自GIBCO公司。

　　1.2 FXYD5全长cDNA克隆 以GenBank中已发表的大鼠FXYD5的cDNA序列(GI:38051987)为模板设计引物(上海生工合成)。SHR和WKY大鼠肾脏组织mRNA由本实验室提供。用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit分别扩增5-RACE(引物R1：CAGTGGATTCTCAATGTAGGATGGAGGC)和3-RACE(引物F1：CCAAGACCCAGCAACTGACCGAAATG)片段，各自与pGEM-T Easy载体连接后，转化DH5α。挑取数个克隆抽提质粒，测序鉴定。然后用EcoR I和Kpn I及Not I和Kpn I分别双酶切上述连接产物，和pBluescript II KS(+/-)载体的Not I、EcoR I双酶切产物同时凝胶回收。T4连接酶连接上述三个酶切片段，得到含全长cDNA的pBluescript II KS(+/-)载体(简称pBS-F)，转化感受态细菌DH5α，蓝白斑筛选，挑取菌落，提取质粒，测序鉴定。

　　1.3 　腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-FXYD5的构建

　　1.3.1 引物设计与合成：正向引物(F2): 5′GGA AGATCT GCCACCATG GAGCAGAAGTTGATCAGCGAGGAGGACCTG ATGTCACGCCCAGTCAGCTG(划线部分依次是Bgl II酶切位点、Kozak序列、c-myc抗原簇编码序列[6])。反向引物(R2):5′CCC AAGCTT TCACCTGTGGCGATTCAGGCA 3′(划线部分为Hind III酶切位点)。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

　　1.3.2 目的基因与穿梭载体的整合：以pBS-F为模板、“F2、R2”为引物、Prime STARTM HS DNA Polymerase扩增FXYD5编码序列。pAdTrack-CMV穿梭载体与PCR产物分别经“Bgl II、Hind III”双酶切。T4连接酶酶切产物(4 ℃, 16 h)后，转化DH5α感受态细菌，在卡那霉素抗性LB平板上培养过夜，挑选菌落，提取质粒后，经“Bgl II、Hind III”双酶切鉴定阳性克隆并测序分析，得到阳性载体(简称pAdTC-FXYD5)。

　　1.4 腺病毒载体的同源重组　用Pme I将pAdTrack- FXYD5 线性化后电转化(BioRad，2 500 V，200Ω，25μF) AdEasier-1 cell，进行菌体内同源重组。在卡那霉素抗性的LB平板上培养过夜，挑取平板上最小的菌落37 ℃培养过夜， E.Z.N.A. BAC/PAC DNA Kit提取载体，经Pac I酶切鉴定筛选阳性重组体(简称Ad-FXYD5)。提取的部分Ad-FXYD5载体转化DH5α感受态细菌，在卡那霉素抗性LB平板上培养过夜，挑选菌落大量培养，E.Z.N.A. Plasmid Maxi Kit提取质粒，备用。

　　1.5 重组腺病毒的包装、扩增 Pac I线性化Ad-FXYD5后, 酚、氯仿抽提酒精沉淀法回收线性化片段约20μg。将4μg线性化载体与25μl solu-tion I、250μl solution II混合，加水补至500μl。上述液体室温静置10 min后，均匀点滴至MBScontaining DMEM孵育了20～30 min的AD293细胞(50%～70%融合)的培养皿内。继续培养3 h后更换含25μmol/L氯喹的普通DMEM高糖培养基，继续培养6～7 h。约10～14 d后，细胞刷收集细胞。收集物在干冰-甲醇浴与37 ℃水浴之间反复冻融后离心，收集病毒上清，继续感染AD293细胞以扩增病毒。

　　1.6 重组腺病毒鉴定 分别用低代的重组病毒液和空病毒液反复感染AD293细胞达到腺病毒的小量扩增后，取100μl病毒液提取DNA，用引物F2、R2进行PCR鉴定，确定阳性重组腺病毒DNA中含有FXYD5基因。

　　1.7 重组腺病毒Ad-FXYD5 的病毒滴度测定 将AD293细胞计数，稀释至1×105个/ml，在96孔板上按100μl/孔接种细胞，培养24 h后，将浓缩后的病毒贮存液按10-1至10-10做梯度稀释后，每个稀释度100μl/孔接种，37 ℃、5% CO2细胞培养箱里培养18 h后，荧光显微镜下进行荧光计数。病毒滴度(pfu/ml)=荧光数×10/稀释度。

　　2 结果

　　2.1 FXYD5全长cDNA克隆 从SHR和WKY大鼠肾脏组织提取的mRNA分别合成第一链cDNA，接着行5RACE、3RACE扩增，扩增产物与T载体连接后，各连接产物再经双酶切，得到pBS-F载体(详见1.2)，挑取10个菌落，提取质粒做双酶切鉴定，选三个阳性载体测序鉴定。双向测序结果证实：①SHR与WKY大鼠比较，FXYD5没有基因突变，序列完全一致;②除位于FXYD5基因G360A同义突变外，经BLAST比对与GenBank公布的FXYD5 mRNA完全一致(见图1)。

　　2.2 重组腺病毒载体的构建与鉴定 以pBS-F载体为模板，F2、R2为引物，扩增基因编码序列。扩增产物经“Bgl II、HindⅢ”双酶切后克隆入pAdTrack-CMV穿梭载体中，得到pAdTC-FXYD5载体。PCR法(引物F1、R1，PCR产物158 bp)筛选阳性克隆，选取三个阳性载体测序证实无误。将鉴定正确的穿梭载体与骨架载体pAdEasy-1在感受态细胞BJ5183中进行菌体内同源重组，Pac I酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳可见酶切片断分别大致位于大于21 kb和4.5 kb或3 kb处，表明同源重组成功(见图2)。

　　2.3 重组腺病毒的表达 重组腺病毒载体经Pac I酶切后，用磷酸钙-DNA共沉淀法转染AD293细胞。激光共聚焦显微镜观测GFP绿色荧光，监测转染效率及病毒扩增 (见图3)。转染后第14天收集细胞，经反复冻融后得到腺病毒液。

　　2.4 重组腺病毒的鉴定与滴度测定 鉴定结果显示重组腺病毒DNA中含有FXYD5基因，后续测序示序列完整无误。重组腺病毒经扩增粗提后，测得病毒滴度为1.36×1010 pfu/ml。

　　3 讨论

　　腺病毒载体是目前应用最广泛的生物病毒载体之一，与其他载体系统比较，它具有以下优点：宿主范围广，包装容量大，在增殖或非增殖细胞中感染和表达基因，能有效进行增殖，滴度高，不整合到染色体中，无插入致突变性，能同时表达多个基因，与人类基因同源。1997年，He等[7]创立pAdEasy系统，实现细菌内高效同源重组，与传统的构建重组腺病毒载体相比，不再进行真核细胞内同源重组和噬斑筛选，克服了周期长、效率低等不足，使操作过程大大简化。因此我们选用pAdEasy系统作为转基因的方法。

　　FXYD蛋白家族成员作为组织特异性Na+-K+-AT-Pase的调节因子，因均含有FXYD基序得名。所有的成员都可以调节钠泵活性，但是每个成员又都有它特异性的组织分布，而且影响钠泵的程度和方式也不尽一样，这是与组织的生理需求相一致的，这就是FXYD蛋白功能的多样性。2002年，在肿瘤细胞中FXYD5被发现。实验说明它是可以下调E-钙黏蛋白表达、降低细胞间黏附、促进细胞运动和转移的“抗黏附分子”[1]。后续的研究证实FXYD5和家族中的其他成员一样，与Na+-K+-ATPase之间有明显的亲和力并且可以提高Na+-K+-ATPase的活性[2]。FXYD5主要表达在肾脏、十二指肠、脾和肺。在肾脏，FXYD5主要分布于皮质部，而在肾脏髓质和肾乳头分布很少，在肾单位中它主要定位在连接小管。集合管的基底外侧膜和集合小管的闰细胞上[2]。另外，FXYD5同家族其他成员比较，它的氨基端即胞外段特别长，而胞内段特别短[8,9]，这预示它有独立于调节钠泵以外的作用。本实验室通过基因芯片筛查，发现该基因的表达水平在SHR组比WKY组下调14.8 倍[5]，预示其在高血压的发生发展中亦有一定作用。

　　钠泵功能的异常与高血压密切相关[3，4，10]。钠泵作为真核细胞膜上的多功能蛋白多聚体，起着维持细胞体积及膜电位离子平衡的作用，参与体内的水和电解质调节。研究认为，钠泵不仅仅是发挥离子转运功能，它更像是一个绞手架/激素受体结构[12]。钠泵区别于其他ATP酶的地方在于它是哇巴因的特异性受体，其与配体结合后，介导了细胞信号传递,对血管紧张性、心肌收缩、细胞增殖和死亡等产生重要影响[11]。另外，所谓的“绞手架结构”是指它与细胞骨架联系紧密，它的β亚单位氨基端聚糖化对细胞间连接的稳定和完整非常重要。钠泵的活性和表达及分布受胞内钠离子、物理因子、激素、神经递质等诸多因素的影响和调节。这些因素包括醛固酮、α-内收蛋白(一种调节肾小管钠泵活性的细胞骨架蛋白)的突变和多肽性、钠潴留、类洋地黄因子等，还有FXYD蛋白家族。其中，FXYD5在肾单位上的定位，让我们考虑它有可能通过调节钠泵影响集合管水盐重吸收，而水盐代谢的紊乱是高血压发病的重要机制。

　　综上，FXYD5与钠泵在调控离子转运、影响细胞间稳定方面都有重要作用，这些都与高血压的病理生理机制密切相关。我们研究的目的就是试图寻找FXYD5与高血压之间的相关性。而FXYD5在正常组织的表达丰度不高，同时这种调节作用主要是翻译后的，有必要建立一种高效表达此基因的体系，便于我们研究其功能。因此，大鼠FXYD5基因的克隆及重组腺病毒载体的构建将为探索FXYD5基因的生物学功能、转基因研究及进一步明确该基因与高血压的相关性奠定基础。

　　【参考文献】

　　[1] Ino Y, Gotoh M, Sakamoto M,et al. Dysadherin, a cancer-associ ated cell membrane glycoprotein, down-regulates E-cadherin and promotes metastasis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A ,2002,99(1):365-370.

　　[2] Lubarski I, Pihakaski-Maunsbach K, Karlish SJ,et al. Interac-tion with the Na,K-ATPase and tissue distribution of FXYD5(related to ion channel)[J]. J Biol Chem, 2005,280(45):37717-37724.

　　[3] Ferrandi M, Manunta P, Ferrari P,et al. The endogenous ouabain: molecular basis of its role in hypertension and car-diovascular complications[J]. Front Biosci, 2005,10:2472-2477.

　　[4] Dostanic-Larson I, Van Huysse JW, Lorenz JN,et al. The highly conserved cardiac glycoside binding site of Na,K-AT-Pase plays a role in blood pressure regulation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(44):15845-15850.

　　[5] 陈长曦,杨德业,余祖善,等.自发性高血压大鼠FXYD5基因的实验研究[J].中华高血压杂志,2007,15(2):119-123.

　　[6] Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecularand biochemical fundamentals to commercial systems[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2003,60(5):523-533.

　　[7] He TC, Zhou S, da Costa LT,et al. A simplified system for gener ating recombinant adenoviruses[J]. Proc Natl Acad Sci U S A ,1998,95(5):2509-2514.

　　[8] Franzin CM, Yu J, Thai K,et al. Correlation of gene andprotein structures in the FXYD family proteins[J]. J MolBiol,2005,354(4):743-750.

　　[9] Sweadner KJ, Rael E. The FXYD gene family of small iontrans port regulators or channels: cDNA sequence,proteinsignature sequence, and expression[J]. Genomics, 2000,68(1):41-56.