基质溶解素-1基因启动子多态性与急性心肌梗死的相关性
发表时间：2010-05-06 浏览次数：489次
作者：高秋琦 作者单位：温州医学院第一附属医院 ICU，浙江 温州 32500
【摘要】 目的: 研究中国南方人群基质溶解素-1基因启动子1612 5A/6A多态性与急性心肌梗死的相关性。方法: 采用DNA测序法检测116例急性心肌梗死患者和105例对照的基质溶解素-1基因启动子序列。结果: ①基质溶解素-1基因启动子1612 5A/6A多态性的三种基因型(5A/5A、5A/6A、6A/6A)符合Hardy-Weinberg分布。②与对照组相比，心梗组的基质溶解素-1基因5A/5A和5A/6A基因型较多见，差异有显著性，P <0.01。③基因型的相对风险分析发现，5A/5A或5A/6A基因型携带者患急性心肌梗死风险是6A/6A基因型的3.050倍(95%可信区间:1.653-5.627)。结论: 基质溶解素-1基因启动子1612 5A/6A多态性可能与中国南方急性心肌梗死的遗传易感性相关联，5A等位基因是急性心肌梗死发病的一个独立危险因素。
【关键词】 基质金属蛋白酶基因 基因多态性 急性心肌梗死 危险因素
Correlative research between polymorphisms of stromeIysin-1 promoter 1612 5A/6A and acute myocardiaI infarction GAO Qiu-qi*，XU Li-xin，TAO Zhi-hua，ZHANG Huai-qin，CHEN Da-kai，LIN Xi-fang. *Department of ICU，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou ，325000
Abstract: Objective: To investigate the relationship between the polymorphism of 1 612 5A/6A in the promoter of the stromelysin-1 gene and the acute myocardial infarction (AMI) in population of southern Chinese. Methods: Using DNA sequencing，the polymorphism of the stromelysin-1 gene was detected in both 116 AMI patients and 105 control subjects. Results: ① The allelic distribution of the stromelysin-1 gene in both groups matched the Hardy-Weinberg equilibrium (P >0.05).② The number of 5A allele of the promoter of the stromelysin-1 gene in patients with AMI was higher than that of the control group (P <0.01).③The odds ratio of the 5A/6A+5A/5A was 3.050(95% CI，1.653 to 5.627). Conclusion: The 1612 5A/6A polymorphism in the promoter of the stromelysin-1 gene is associated with AMI in southern Chinese. The 1612 5A allele in the promoter of the stromelysin-1 gene may play an important role in the pathogenesis of AMI.
Key words: metalloproteinases gene;gene polymorphsim;acute myocardial infarction;risk factors
冠心病是一类多基因多因素疾病，有许多侯选基因参与疾病的发生。国内外学者研究表明，基质溶解素-1(stromelysin-1)基因启动子多态性与冠心病的发生和发展存在一定的相关性。本研究对116例急性心肌梗死患者组(心梗组)和105例研究对照组的基质溶解素-1基因启动子序列进行检测，通过比较基因型和等位基因频率在两种群体中的分布，分析急性心肌梗死的危险因素，评价基质溶解素-1基因启动子1 612位点5A/6A多态性与急性心肌梗死发病的相关性。
1 对象和方法
1.1 研究对象
1.1.1 心梗组：2002年7月至2003年11月收住温州医学院第一附属医院心内科，临床诊断为急性心肌梗死的患者共116例，年龄(67.9±9.8)岁，其中，男89例，女27例。急性心肌梗死的诊断标准参考文献[1]。
1.1.2 研究对照组:冠脉造影正常者67例，心肌桥者10例，健康体检者28例，年龄(66.0±9.3)岁，其中，男81例，女24例。
研究人群均为浙江温州地区汉族人群，无血缘关系。排除肝病、系统性红斑狼疮、恶性肿瘤、银屑病、甲状腺功能异常、深静脉血栓形成等疾病，并获受试者知情同意。
1.2 研究方法
1.2.1 标本采集与DNA提取：①采用密度剃度离心法分离EDTA-Na2抗凝的3 ml静脉血，分离出的单个核细胞在-70 ℃保存。②DNA提取按上海生工的人类基因组DNA提取试剂盒进行。
1.2.2 引物设计与合成：参考文献[2]在特异性扩增基质溶解素-1基因启动子1612 5A/6A多态性区设计一对引物，正向引物：5'GATTACAGACATGGGTCACG3'，反向引物：5'CATCACTGCCACCACTCTG3'，由上海生工合成。
1.2.3 PCR扩增：①反应液组成：dNTP 0.2 nmol/L，引物200 nmol/L，PFU 1U/test，PFU缓冲液。②DNA模板量：基因组DNA 2μl(大约1.5μg)。③循环扩增条件：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共33个循环;最后72 ℃延伸5 min。④凝胶电泳：2%琼脂糖凝胶电泳，80 V×30 min，溴化乙锭染色，在紫外分析仪下观察，目标条带采用德国QALTMquick GEL RETRIT KIT进行回收。
1.2.4 测序反应：①引物设计：取上述PCR引物中的一条正向引物作为测序引物。②测序PCR扩增反应：引物(5μmol/L)1μl，mix(CEQTM DTCS-Coffret Quick Start Kit)4μl，胶回收的PCR扩增产物5μl(大约100 ng)组成反应液，92 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，60 ℃ 4 min，共30个扩增循环。③测序反应产物的纯化(低温乙醇纯化法)，按操作说明书进行。④在BeackmanCEQ8000测序仪上检测基因型：测序参数：变性：90 ℃，120 s;注射：电压2.0 kV，15 s;分离：电压4.2 kV，45 min。
1.3 统计学处理方法 三种基因型和两种等位基因频率与急性心肌梗死的关系用x2检验分析;基因型、等位基因、血清总胆固醇水平、性别、年龄、高血压、糖尿病与急性心肌梗死之间的关系用logistic回归分析。
2 结 果
2.1 急性心肌梗死组和对照组stromelysin-1基因的基因型分析
2.1.1 stromelysin-1基因基因型的测序结果：221个DNA样本中有13个样本判断为5A/5A基因型(如图1a);有80个样本判断为5A/6A基因型(如图1b);有128个样本判断为6A/6A基因型(如图1c)。
2.1.2 stromelysin-1基因启动子1612 5A/6A多态性的Hardy-Weinberg分布检验：经H-W分布检验发现，心梗组116例中，三种基因型实际值分别为10、50和56，期望值分别为10.56、48.88和56.56，x2=0.062，P>0.05。在对照组105例中，三种基因型实际值分别为3、30和72，期望值分别为3.08、29.82和72.09，x2=0.0031，P>0.05,见表2，均符合H-W分布。
2.1.3 stromelysin-1基因在急性心肌梗死组和对照组的分布：对照组以6A/6A基因型最常见，5A/6A基因型次之，5A/5A基因型最少见。心梗组以6A/6A基因型最常见，5A/6A基因型次之，5A/5A基因型最少见。与对照组相比，心梗组stromelysin-1基因的5A/5A、5A/6A基因型和5A等位基因较多见，差异有显著性(P<0.01)，见表1。stromelysin-1基因在心梗组和对照组的分布差异有显著性。
2.2 急性心肌梗死疾病相关因素分析
2.2.1 经典危险因子与急性心梗的相关性：急性心肌梗死人群与年龄、吸烟、血清胆固醇水平及是否存在高血压、糖尿病有关，而与性别无相关，见表2。
2.2.2 stromelysin-1基因型与急性心梗的相关性：在logistic回归方程中5A/5A+5A/6A基因型的相对危险度为3.050(95% CI，1.653 to 5.627)，说明携带stromelysin-1基因启动子5A等位基因者患急性心肌梗死的风险明显增高，见表2。
3 讨论
5A/6A多态性属于连续型腺嘌呤缺失变异。检测这种单核甘酸变异，比较敏感和特异的方法只有测序法和寡核甘酸探针法。在目前检测DNA突变和多态性的多种方法中，最准确的方法是Sanger等[3](1977)提出的双脱氧法DNA序列测定，这是确定DNA突变和多态性的金标准。通过双脱氧法DNA序列测定，我们检测出中国南方汉族人群stromelysin-1基因启动子1612位点存在5A/6A多态性。心梗组和对照组均以6A/6A基因型最常见， 5A/5A基因型最少见。本研究检测到的stromelysin-1启动子1612位5A/6A突变率为0.30，与Terashima等[4]检测到的突变率0.43有差异，可能和人种不同有关。Zhou等[5]报道的急性心梗人群突变率为0.19，和本研究检测到的正常人群突变率0.17相近，说明南北方人群也可能存在差异。
由于本研究心梗组和对照组的5A/5A基因型均较少(10/116：3/132)，两组5A/5A与5A/6A基因型比较差异无显著性，我们将5A/5A与5A/6A基因型合并进行进一步分析。在Logistic回归方程中，携带有5A/5A或5A/6A基因型者比6A/6A基因型患病风险增加205.0%。结果表明stromelysin-1基因启动子1612 5A/6A多态性可能与急性心肌梗死的发病相关，其风险程度较经典因子更强。5A等位基因可能是急性心肌梗死发病的基因危险标志，其最可能的机制是5A等位基因使stromelysin-1基因在转录时具有去阻遏功能，导致stromelysin-1合成增多，降解纤维帽，导致斑块的破裂，使冠脉血流受阻，引起急性心肌梗死。
本研究检测还发现，年龄、吸烟、高血压均是冠心病的易患因素。65岁以上同时有高血压并携带5A等位基因者患急性心肌梗死的概率增加264.7%;携带5A等位基因者如长期吸烟,则患急性心肌梗死的概率增加292.3%。在携带stromelysin-1基因5A等位基因时，这些易患因素的存在使急性心梗的发病率增高。
【参考文献】
参考文献:
[1] 中华医学会心血管病学分会,中华心血管病杂志编辑委员会,中国循环杂志编辑委员会. 急性心肌梗死诊断和治疗指南[J]. 中华心血管病杂志,2001,29(12):710-725.
[2] Kim JS, Park HY, Kwon JH,et al. The Roles of Stromelysin-1 and the Gelatinase B Gene Polymorphism in stable Angina[J]. Yonsei Med J, 2002,43(4):473-481.
[3] Chan EY. Advances in sequencing technology[J]. Mutat Res,2005,573(1-2):13-40.
[4] Tershima M, Akita H,KanazawaK,et al.Stromelysin Promoter 5A/6A polymorphism is associated with acute Myocardial Infarction[J]. Circulation, 1999,99(21):2717-2719.
[5] Zhou X, Huang J, Chen J, et al.Haplotype analysis of thematrix metalloproteinase 3 gene and myocardial infarctionin a Chinese Han population.The Beijing atherosclerosisstudy[J]. Thromb Haemost, 2004, 92(4):867-873.
