Pax-8基因在心脏发育中蛋白表达下调

　　作者：倪秋明，章佳颖，来丹丹，褚茂平，王赛斌，黄晓燕，张怀勤，杨德业 作者单位：温州医学院附属第一医院 心血管内科，温州医学院 心血管生物和基因研究所，浙江 温州 325000

　　【摘要】 目的:观察Pax-8基因在ALK3基因敲除小鼠心脏中的蛋白表达情况，探讨Pax-8基因在心脏发育中的作用。方法:基因芯片(microarray)和定量逆转录-聚合酶链反应测定ALK3基因的下游基因，免疫组化法检测13.5 d小鼠胚胎心脏特异性ALK3基因敲除小鼠胚胎中Pax-8蛋白的表达，连续病理切片及HE染色观察刚出生的Pax-8基因敲除小鼠的心脏形态。结果：在心脏特异的ALK3基因敲除小鼠中，转录因子Pax-8基因mRNA的表达水平上被下调7.1倍。免疫组化结果显示：13.5 d小鼠胚胎心脏特异性 ALK3基因敲除的纯合子小鼠Pax-8基因在蛋白水平与杂合子相比也明显下调。Pax-8基因敲除小鼠纯合子有明显的室间隔和左心室肥厚，心脏呈球形。结论:Pax-8基因是ALK3基因的下游基因，与心脏发育有密切关系。

　　【关键词】 Pax-8基因;室间隔缺损;免疫组化;蛋白表达

　　Down-regulated protein expression level of Pax-8 gene during heart development in mice NI Qiu-ming，ZHANG Jia-ying，LAI Dan-dan，CHU Mao-ping，WANG Sai-bin，HUANG Xiao-yan，ZHANG Huai-qin，YANG De-ye. Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital & Institute of Cardiovascular Biology & Gene， Wenzhou Medical College， Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To investigate the level of Pax-8 protein expression in the condi-tional ALK3 kockout mice heart and study the role of Pax-8 gene in the cardiac development. Methods: The microarray and real time quantitative RT-PCR were used to investigate the down-stream genes of ALK3. Immunohistochemical technology was used to detect the level of Pax-8 protein expression in the 13.5 d heart derived from a-MHC Cre+/-，ALK3 F/- and a-MHC Cre+/-，ALK3 F/+ mice. To study the contribution of Pax-8 gene in the cardiac development，the heart derived from pax-8 kockout mice was overviewed using consecutive pathological section and HE staining method. Results:The level of Pax-8 mRNA expression was down-regulated 7.1 fold in the embryonic heart (11.5 days) of a-MHC Cre+/-，ALK3 F/-. The level of Pax-8 protein expression was also remarkably down-regulated in the embryonic heart (13.5 days) of a-MHC Cre+/-，ALK3 F/-. The heart of pax-8 KO-/-mice became spheroidal，the left ventricle enlarged， left ventricular wall and interventricular septum thickened， papillary muscles in the left ventricle enlarged. Conclusion: Pax-8 gene is the cardiac-specific ALK3 downstream gene. Pax-8 may play important roles in the cardiac development.

　　Key words: Pax-8 gene;ventricular septal defect;immunohistochemistry ;protein expression

　　先天性室间隔缺损的发病机制尚不十分清楚。近年来，美国Schneider教授使用a-MHC Cre+loxP系统[1](心脏特异性敲除系统)对心脏ALK3基因进行特异性地敲除，ALK3基因敲除的纯合子小鼠死于胚胎中期，并有室间隔缺损、心内膜垫和肌小梁发育不良[2]。然而，ALK3基因是与心脏发育有关的比较上游的基因。为了研究ALK3下游的并有心脏特异性的基因，在ALK3基因敲除和Pax-8基因敲除小鼠模型上，观察Pax-8基因在心脏中的蛋白表达情况，以探讨Pax-8基因在心脏发育中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物 20只 a-MHC Cre +/-、ALK3+/-(a- MHC为启动子的Cre重组酶转基因杂合子，ALK3系统基因敲除的杂合子小鼠)和20只ALK3 F/F(在ALK3基因第2个外显子两端插入lox P序列的小鼠)的C57小鼠(由美国Schneider教授提供)交配，可得到在心脏纯合子ALK3基因敲除(a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-)的小鼠胚胎和杂合子ALK3基因敲除(a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+)的胚胎。 Pax-8基因敲除的纯合子小鼠(Pax-8 KO -/-)和Pax-8基因敲除的杂合子小鼠(Pax-8 KO +/-)由德国Gruss和Mansouri教授惠赠。

　　1.2 总RNA的提取 首先收集试验组和对照组的11.5 d小鼠的胚胎心脏，然后用总RNA试剂盒(美国QIAGEN公司生产)提取和纯化总RNA。

　　1.3 基因芯片[3] 德国生产的25 000个小鼠基因的基因芯片被用于比较两组11.5 d小鼠胚胎心脏总RNA。 试验组的总RNA来自a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-的11.5 d小鼠胚胎心脏，对照组的总RNA来自a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+ 的11.5 d小鼠胚胎心脏。

　　1.4 定量逆转录-聚合酶链反应[4] Taq Man一步法聚合酶链反应试剂盒(美国Perkin-Elmer公司生产)被用于定量RT-PCR。每个PCR反应孔使用100 ng的总RNA。试验组的RNA来自a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-的11.5 d小鼠胚胎心脏，对照组的RNA来自a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+的11.5 d小鼠胚胎心脏。cDNA合成的条件是48 ℃、30 min。cDNA经过40个PCR周期被扩增。在PCR扩增前首先用95 ℃、10 min使cDNA变性。每个PCR周期由 95 ℃、15 s(变性)加上60 ℃、1 s(退火+延伸)。每种RNA同时做3个条件完全相同的PCR反应孔。所有PCR有效性在95%以上。ABI PRISM 7700序列检测仪(美国Perkin-Elmer公司生产)被用于定量RT-PCR的检测。转录因子Pax-8的荧光素探针序列是：6 FAM-TGT CCC CAG TGT CAG CTC CAT CAA CA-TAMRA。Pax-8的正向引物序列是：5’-CAG AAG GCG TTT GTG ACA ATG A- 3’。Pax-8的逆向引物序列是：5’-GCA CTT-TGG TCC GGA TGA TT-3’。定量RT-PCR内部对照基因36B4的荧光素探针序列是：6FAM-CCA GGC TTT GGG CAT CAC CAC G-TAMRA。36B4的正向引物序列是：5’-GGA CCC GAG AAG ACC TCC TT-3’。36B4逆向引物序列是：5’-TCA ATG GTG CCT CTG GAG ATT-3’。

　　1.5 免疫组化染色 试验分A、B、C、D四组，A组(试验组)为a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)小鼠胚胎6只，B组(对照组)为a-MHC Cre +/-、 ALK3 F/+(杂合子)的小鼠胚胎6只，C组(阴性对照组)为Pax-8 KO -/-(纯合子)6只，D组(阳性对照组)为刚出生正常C57小鼠6只。取13.5 d a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)和a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+(杂合子)以及13.5 d的Pax-8 KO-/-(纯合子)的小鼠胚胎心脏，刚出生C57小鼠取甲状腺组织。免疫组化采用SABC法，具体步骤参照免疫组化试剂盒(Proteintech生物技术有限公司生产)说明书。免疫组化染色图片每张切片光镜下放大400倍，随机抽取3～5个视野，用Advanced spot拍照系统进行拍照保存。应用IPP分析软件测定图片的累计光密度值(OD值)。

　　1.6 HE染色 试验组为19.5 d(刚出生)Pax-8 KO -/-(纯合子)的小鼠，对照组为19.5 d(刚出生)Pax-8 KO +/-(杂合子)的小鼠，按常规做四腔心切片，切片厚度约3 μm，切片用HE法染色来观察心脏大体形态。HE染色图片，在光镜下放大20倍，直接观察，拍照。

　　1.7 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件，多组之间均数的两两比较采用SNK-q检验。

　　2 结果

　　2.1 心脏特异ALK3基因敲除小鼠的获得 雌的α-MHC Cre +/-、ALK3 +/- 和雄的ALK3 F/F (在ALK3基因第二外显子两边插入Lox P的片段) 交配可获得α-MHC Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)和α-MHC Cre +/-、ALK3 F/+(杂合子)的小鼠胚胎。

　　2.2 Pax-8基因敲除小鼠的获得 雌的Pax-8 KO +/- 和雄的Pax-8 KO +/-交配可获得Pax-8 KO -/-(纯合子)和Pax-8 KO +/-(杂合子)。

　　2.3 用基因芯片的方法获得的ALK3下游的可能基因 将25 000个基因在试验组和对照组中的mRNA表达水平进行比较，增加或减少两倍以上为阳性。Pax-8及Hox-3.5等12个基因在a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-小鼠胚胎心脏中的表达下调，见表1。Ras相关蛋白Rab-5b及EPS-8蛋白等16个基因在a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-小鼠胚胎心脏中的表达是上调的，见表2。

　　2.4 定量RT-PCR结果 转录因子Pax-8基因在α-MHC Cre +/-、ALK3 F/-组小鼠比α-MHC Cre +/-、ALK3 F/+ 组小鼠表达水平低7.1倍(P <0.01)。而作为定量RT-PCR内部对照的36B4基因的表达水平在两组间的差异无显著性。见图1。

　　2.5 免疫组化染色结果

　　2.5.1 试验组a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)心脏中Pax-8阳性染色比较少，每个视野下只有少数细胞核呈阳性，被染成棕黄色，而α-MHC Cre +/-、ALK3 F/+(杂合子)心脏对照组每个视野下可见大量阳性细胞，细胞核被染成棕黄色。C57小鼠甲状腺阳性对照组也可见大量阳性细胞表达，而Pax-8 KO -/-(纯合子)小鼠阴性对照组心脏未见DAB染色及阳性细胞表达(见图2)。

　　2.5.2 图片分析及统计学处理结果: 四组Pax-8免疫组化染色的图像分析数据及其统计分析结果见表3。

　　2.6 HE染色结果 Pax-8 KO -/-(纯合子)小鼠，四腔心切片，HE染色，有明显左室肥大及室间隔肥厚，对照组Pax-8 KO +/-(杂合子)小鼠心脏形态未见明显异常(见图3)。

　　3 讨论

　　Pax基因是编码转录因子的发育控制基因的超家族，它包括9个成员，即Pax 1～9[5-6]。Pax-8基因是Pax基因家族的一个成员，定位于人类染色体2q12-14[7-8]，在小鼠定位于染色体2，人和小鼠的Pax-8基因的保守区域结构特征相似，都编码128个氨基酸的成对结构域(PD)。Pax-8基因的表达具有组织器官特异性，通过原位杂交方法证实，其mRNA在发育中的脑、肾、甲状腺及成熟的肾、甲状腺中存在。Pax-8基因在甲状腺发育中起重要作用。

　　ALK3基因是心脏发育和室间隔形成的重要基因，小鼠ALK3基因心脏特异性敲除后，小鼠出现室间隔缺损、心内膜垫和肌小梁发育不良[1]。为了研究ALK3的下游基因，我们实验室利用基因芯片与PCR选择性cDNA减数法筛选出Pax-8及Hox-3.5等12个基因在α-MHC Cre +/-、ALK3 F/-小鼠胚胎心脏中mRNA表达是下调的，其中Pax-8基因的表达下降了7.1倍。原位杂交证实Pax-8基因仅表达于ALK3基因敲除杂合子的小鼠胚胎心脏，而不见于ALK3基因敲除的纯合子。通过免疫组化技术检测Pax-8基因在ALK3基因敲除小鼠心脏的蛋白水平中的表达，从而进一步探讨Pax-8基因在心脏发育过程中的作用，及其与先天性心脏病的关系。实验证实了Pax-8基因在ALK3基因敲除纯合子小鼠心脏的室间隔在蛋白水平表达上与杂合子组相比也明显减少，而在Pax-8基因敲除的纯合子小鼠未见表达。以上研究表明，心脏特异性ALK3基因敲除小鼠的Pax-8基因在mRNA和蛋白水平上都明显下调，从而可以证明Pax-8基因与心脏发育密切相关。通过对Pax-8基因敲除小鼠纯合子和杂合子心脏连续病理切片、HE染色后发现，19.5 d(刚出生)的小鼠心脏表现为室间隔明显肥厚，左心室肥大，形状呈球形。Okuno 研究证明Pax-8基因敲除小鼠在生长发育过程中与杂合子相比，个体明显偏小，步态不稳，且死于断乳期[9]。本实验可以从mRNA和蛋白水平方面证实Pax-8基因是ALK3基因的下游基因，在心脏发育中起了重要的作用。一般来说，越下游的基因组织特异性越强，Pax-8下游基因是什么还需要进一步的实验研究证实。

　　【参考文献】

　　[1] Fukushipe S , Ikoda J. Trapping of mammalian promoters byCre-lox site specific recombination[J]. DNA Res , 1996 , 3(2): 73-80.

　　[2] Gaussin V, Van de putte T, Mishina Y, et al. Endocardialcushion and myocardial defects after cardiac myocyte-spe-cific conditional deletion of the bone morphogenetic proteinreceptor ALK3[J]. Proc Na Acad Sci USA, 2002, 99: 2878-2883.

　　[3] Pollak ES, Feng L, Ahadian H, et al. Microarray-based geneticanalyses for studying susceptibility to arterial and venousthrombotic disorders[J]. Ital Heart J, 2001, 2(8): 568-572.

　　[4] Gibson UEM, Heid CA, Williams PM. A novel method forreal time quantitative RT-PCR[J]. Genome Res, 1996, 6(1):995-1001.

　　[5] Lang D, Powell SK, plummer RS, et al. Pax genes:roles indevelopment, pathopysiology, and cancer[J]. Biochem phar-m-acol, 2007, 73(1):1-14.

　　[6] Stuart EL Gruss P. PAX gene: what's new in developmentbiology and cancer [J]. Human Molecular Genetics,1995,4(9):1717- 1720.

　　[7] Walther C,Guenet JL, Simon D,et al.Pax-a murine multigenefamily of paired box-containing genes[J]. Genomics,1991,11:424-434.

　　[8] Stapleton P, Weith A, Urbanek P, et al .Chromosomal local-ization of seven PAX genes and cloning of a novel familymember, PAX-9[J]. Nat Genet,1993(4): 292-298.

　　[9] Mansouri A, Chowdhury K, Gruss P. Follicular cells of thethyroid gland reqire pax-8 gene function[J]. Nat Genet,1998, 19(1):87-90.