实时定量PCR法检测骨髓间充质干细胞移植到梗死心肌后的存活数量

　　作者：王业焕，张浩，袁昕，侯剑锋，刘学彬，叶珏，孙成超 作者单位：(1.温州医学院附属第一医院 心胸外科，浙江 温州 325000;2.中国医学科学院阜外心血管病医院、 卫生部心血管疾病再生医学重点实验室，北京 100037;3.中国医学科学院阜外心血管病医院 中心实验室，北京 100037)

　　【摘要】 目的 ：建立一种干细胞移植到梗死心肌后检测其存活数量的有效方法。方法 ：选取10只雌性SD大鼠结扎前降支，心肌梗死3周后，随机分成移植组与对照组，同时选取雄性大鼠培养出骨髓间充质干细胞(MSCs)，分别将MSCs(3×106个，50μL)及等体积的PBS液移植到梗死心肌中，24 h后通过实时定量PCR(Real-time PCR)检测雄性大鼠Y染色体上特有的基因SRY，从而得知移植MSCs的存活数量。结果：MSCs移植24 h后，移植组梗死心肌中检测到SRY基因数占移植总数的14.9%±8.3%，存活细胞的绝对数量为447 195±248 090，而对照组均未检测到SRY基因的存在。结论：用Real-time PCR的方法能有效地检测到具有SRY基因的干细胞，从而能准确地得知移植干细胞的存活数量，Real-time PCR技术在心梗后干细胞移植的基础研究及临床应用中具有重要的价值。

　　【关键词】 实时定量PCR;心肌梗死;细胞移植

　　Detection of the survival number of the bone marrow derived from mesenchymal stem cells implanted into myocardial infarction with Real-time PCR WANG Ye-huan*，ZHANG Hao，YUAN Xin，HOU Jian-feng，LIU Xue-bin，YE Jue，SUN Cheng-chao. *Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To establish an effective method to detect surviving number of the stem cells in vivo. Methods: Ten adult female SD rats were randomly assigned into two groups: the bone marrow derived from mesenchymal stem cells (MSCs) transplantion group and the control group. Anterior myocardial infarction was induced by ligation of the proximal left anterior descending artery. Using an insulin syringe， PBS (50μL) and MSC (3×106/50μL) of male rat sources were injected into infarcted area in transplantation group and control group，respectively. To evaluate the viability of MSCs injected into infarcted area， Real-time PCR was used to detect the SRY gene which is a specific marker of Y chromosome in 24 hours after MSC transplantation. Results: Twenty four hours after MSC transplantation， the cells were detected in the infarcted myocardium in six rats of transplantation group. The number of surviving cells was 447 195±248 090 ;the number of detected SRY to the number of transplanted cells was 14.9%±8.3%. In contrast，no sry gene were detected in control group. Conclusion: Real-time PCR is a sensitive and accurate method to detect the viability of transplanted stem cells in infarcted myocardium， and this method is valuable for both the laboratory study and clinical practice in the field of stem cell therapy for myocardial infarction.

　　Key words: Real-time PCR;myocardial infarction;cell transplantation

　　心肌梗死后，心肌细胞可出现永久性的丢失，且成熟心肌细胞不可再生，现有治疗手段也无法促使心肌细胞再生，因此，使用干细胞移植到受损心脏中替代坏死心肌细胞，以修复心肌结构和功能，近年来备受广大研究者的关注并已取得了令人鼓舞的成果。但其也存在着很多有待解决的问题，其中的核心问题是移植干细胞在宿主体内的去向和命运。由于技术上的原因，目前尚难以对干细胞移植后在体内的存活、滞留、分布情况进行准确量化。为了追踪观察移植干细胞的存活、滞留、分布情况，必须运用一种有效的检测手段来对移植细胞加以识别和监测。我们利用实时定量PCR(Real-time PCR)的方法有效地检测出具SRY基因的干细胞在梗死心肌中的存活数量，这为干细胞移植到梗死心肌后检测其存活量提供了一种有效的检测方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 10只SPF级雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠，体重200～250 g，用来制作心梗模型;2只雄性SD大鼠，体重60～80 g，用来培养骨髓间充质干细胞。实验动物均由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供。所有动物试验均得到中国医学科学院阜外心血管病医院实验动物委员会的批准。

　　1.2 心梗模型的制作 结扎雌性SD大鼠左室前降支近端来制作心肌前壁梗死模型。用10%的水合氯醛3 mL/kg进行腹腔注射，当大鼠完全麻醉后，用18 G的静脉内导管针经口气管插管，每分钟给予2～3 L氧气，经左第四肋间进入胸腔，显露出心脏，在左心耳和肺动脉圆锥间用6-0 polyproplene线结扎左室前降支，成功的心梗模型可见到结扎远处心肌颜色由粉红变为苍白，同时心电图机上显示出室性心律失常波形，切口用3-0的丝线逐层缝合[1]。

　　1.3 移植细胞的培养 利用全骨髓贴壁法得到原代间充质干细胞。MSCs培养在含15%的热灭活胎牛血清及100 U/mL青链霉素溶液中，细胞孵育放置在37 ℃包含有5% CO2和95%的湿度的孵育箱中[2]。试验所用的细胞均为第三代细胞。

　　1.4 细胞移植 从培养瓶中消化下第三代间充质干细胞，在倒置显微镜下准确地细胞计数。心梗3周后，随机将心梗大鼠分成移植组(n=6)与对照组(n=4)，将大鼠麻醉后在左胸第五肋间开胸，用胰岛素针抽取含有3×106个MSCs的PBS悬混液50μL，注射入梗死区。对照组注射同体积的PBS液。

　　1.5 取材 细胞移植24 h后，将大鼠全身麻醉，静脉快速推注高浓度KCl，心脏停搏在舒张期，迅速剪下心脏，用PBS冲洗尽血液，剪下左室游离壁称重放入液氮中贮藏至DNA的提取[3]。

　　1.6 用Real-time PCR定量分析Y染色体DNA 细胞和组织的DNA利用Wizard Genomic DNA Purifi-cation Kit提取，提取后的DNA用100μL试剂盒中的DNA再溶解液溶解，用分光光度测定法测定DNA的纯度及总量。Real-time PCR用SYBR-Green I法执行。SYBR-Green I染料与双链DNA结合发出荧光信号。应用7300 Real-time PCR System(ABI公司提供)来检测荧光信号。目的基因位于雄性SD大鼠SRY基因上一段特定的序列。用雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA来做标准曲线。引物(10μM)分别为5’-CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA-3’和5’-ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC-3’[4]。每个待检样品中包含有：10μL的目标DNA、每条引物各1μL、12.5μL的Power SYBR Green PCR Master Mix (ABI公司提供)和0.5μL的DEPC水。循环条件是：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min。样品扩增后，用获得的溶解曲线来判定特异性产物及非特异性产物。

　　1.7 统计学处理方法 两样本均数的比较用t检验。

　　2 结果

　　10只大鼠均成功地建立起心肌梗死模型，二次开胸细胞移植后大鼠均存活。组织DNA经提取后，利用Real-time PCR对SRY基因数进行检测，基因扩增曲线符合分析标准，结果在细胞移植24 h后移植组大鼠左室游离壁可检测到的SRY基因数为447 195±248 090，占移植总数的14.9%±8.3%，而在对照组均未检测到SRY基因。具体数据如表1所示(1#～6#为移植组，7#～10#为对照组)。

　　3 讨论

　　实验表明，人和动物心肌梗死后进行细胞移植能阻止心脏的膨大和心功能的恶化[5-8]。细胞移植可致血管新生、基质重构、心功能改善。局部心功能的改善与移植细胞的存活数量成正比关系[9]。目前用来检测心梗后移植细胞存活数量的方法有显微镜下的观察、β半乳糖苷酶活性分析和TUNNEL染色分析，但是这些方法都是半定量的，不能提供准确有效的细胞存活数据。

　　Y染色为雄性动物细胞核内特有，我们可以利用这个特点对Y染色体中某个特定的基因进行准确有效地检测，从而得知细胞数量。1999年Lee等[10]就利用这个特点成功地检测到了移植到女性体内的男性白细胞的存活数量。

　　2002年Müller-Ehmsen等[11]将致死的新生Fischer 344大家的雄细胞移植到雌性的心脏中后用Real-time PCR检测SRY基因的数量，在1 h后可检测到33%，24 h后仅可检测到2.2%。因此我们可以将Real-time PCR在24 h后检测的SRY基因认作只是存活细胞的SRY基因，亦即检测到多少SRY基因对应就有多少存活的细胞。

　　应用Real-time PCR技术检测雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞在心梗心肌中的存活数量需要注意如下几点：①选择适合的引物;②控制好循环条件;③准确地判断扩增产物的特异性。

　　本实验成功地应用了Real-time PCR技术检测出骨髓间充质干细胞移植到心肌梗死中央区24 h后细胞的存活数量(447 195±248 090)，而在对照组却未能够检测到细胞。移植组中还有大部分的移植细胞未检测到，其中的可能原因有：①细胞移植时不可避免的有部分细胞从移植部位漏出;②移植细胞在心梗部位的恶劣环境中可能因遭致低氧、炎症、免疫后凋亡或死亡[12];③部分细胞经血管或淋巴管分布到了其他脏器中[13]。因为提高移植细胞在梗死心肌中的存活数量，能加大细胞移植后心脏功能的恢复，所以准确有效地检测移植细胞存活数量的方法对于科学地移植细胞有着重大的意义。

　　【参考文献】

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