前列地尔后处理对兔再灌注心肌离子通道的影响

　　作者：高航 杨美婷 作者单位：(辽宁医学院附属第一医院心血管内科，辽宁 锦州 121001)

　　【摘要】 目的 研究前列地尔后处理对兔缺血/再灌注心肌细胞膜离子通道活性的影响及对缺血/再灌注心肌的保护机制。方法 采用兔心肌缺血/再灌注模型，将32只雄性日本大耳白兔随机等分为4组:假手术组(S)、缺血再灌注组(I/R)、缺血后处理组(Ipost)、前列地尔后处理组(PGE)。测定心肌可溶性细胞间黏附分子1(sICAM1)和髓过氧化物酶(MPO)含量及Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶活性。结果 与I/R组比较,Ipost和PGE组心肌中sICAM1、MPO含量显著降低和离子通道活性明显升高(P<0.01)。结论 前列地尔后处理减少中性粒细胞的浸润，提高离子通道活性，可能是其发挥心肌保护作用的机制之一。

　　【关键词】 Na+K+ATP酶;Ca2+ATP酶;心肌缺血/再灌注;前列地尔;后处理

　　血运重建术后的再灌注损伤已成为影响急性心肌梗死患者预后的一个重要因素，缺血/再灌注(I/R)损伤机制之一是过度的炎症反应。中性粒细胞可以通过多种途径介导I/R损伤〔1〕，抑制细胞膜离子通道活性是其损伤心肌的途径之一。后处理无须预先判断疾病的发生，在临床上易于实施。前列地尔脂微球是依据靶向药物转运理念制成的前列腺素E1(PGE1),基础实验证实〔2,3〕，于缺血前或再灌注结束后给予前列地尔，可明显减轻缺血心肌的再灌注损伤。然而于心肌再灌注开始时给予前列地尔的研究少见报道，特别是前列地尔在心肌I/R过程中对细胞膜离子通道的影响鲜见报道。本研究目的在于观察前列地尔后处理能否减少中性粒细胞的浸润，保护细胞膜离子通道活性，从而减轻缺血心肌再灌注损伤，为急性冠脉事件中应用前列地尔提出新的理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂 前列地尔注射液(凯时)为北京泰德制药有限公司生产，肌酸肌酶(CKMB)、可溶性细胞间黏附分子1(sICAM1)、髓过氧化物酶(MPO)、Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供。

　　1.2 动物 雄性日本大耳白兔32只，体重2～2.5 kg，由辽宁医学院动物中心提供。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物模型制备 用10%水合氯醛(3 ml/kg)将兔麻醉后，固定，接动物呼吸机，接Ⅰ、Ⅱ导联心电图，切开皮肤，沿胸骨左缘剪开第3～5肋软骨，撑开胸腔切口，用止血钳将左心耳提起，于左心耳下0.3 cm处的冠状动脉左心室支穿3.0丝线，结扎60 min，剪开结扎线，再灌注120 min。结扎后Ⅰ﹑Ⅱ导联ST段弓背向上抬高，T波高耸，心肌颜色变苍白标志心肌缺血造模成功。放松结扎线后，抬高的ST段下降大于50%以及局部心肌变红为心肌再灌注造模成功。

　　1.3.2 分组及处理 将32只兔随机等分成4组。①假手术组(S)：剪开心包，穿线而不结扎冠状动脉，于颈静脉缓慢推生理盐水20 ml。②I/R组:结扎60 min后松开，于颈静脉缓慢推生理盐水20 ml，再灌注120 min。③缺血后处理组(Ipost)：结扎60 min后，开放30 s ，再阻断30 s，重复3次，余同I/R组。④前列地尔后处理组(PGE):缺血60 min，于再灌注前颈静脉插管缓慢静推前列地尔注射液10 mg/kg+生理盐水共20 ml,余同I/R组。

　　1.3.3 观察指标与检测方法 再灌注120 min结束后立即于左颈动脉插管取血2 ml，采用比色法检测血清CKMB含量。再灌注结束后迅速摘取动物心脏，于结扎线下0.2 cm处，取左室壁非梗死区心肌约2 g，制备心肌组织匀浆，采用比色法检测MPO含量，采用酶联免疫吸附法测定sICAM1含量，按照试剂盒说明书操作测定Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶活性。另取左室壁非梗死区心肌，石蜡包埋切片HE染色处理。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0分析软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，多组间显著性检验采用单因素方差分析，两组间差异采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组兔血清CKMB及心肌sICAM1和MPO的含量 与S组比较，I/R组、Ipost组、PGE组血清CKMB及心肌sICAM1和MPO含量均明显增高(均P<0.01);与I/R组比较，Ipost组、PGE组血清CKMB及心肌sICAM1和MPO含量均显著降低(均P<0.01);Ipost组与PGE组血清CKMB及心肌sICAM1和MPO含量无显著性差异(P>0.05)。见表1。表1 各组血清CKMB及心肌sICAM1和MPO的含量(x±s，n=8)与S组比较：1)P<0.01，与I/R组比较：2)P<0.01;下表同

　　2.2 各组兔心肌Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶的活性 与S组比较，I/R组、Ipost组、PGE组心肌Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶活性均明显降低(均P<0.01);与I/R组比较，Ipost组、PGE组心肌Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶活性均显著增高(均P<0.01);Ipost组与PGE组心肌Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶活性无显著性差异(P >0.05)。见表2。

　　2.3 各组兔心肌细胞结构的改变 光镜下可见S组心肌纤维排列整齐，心肌细胞轻微肿胀，核无改变，血管轻微扩张;I/R组间质水肿，肌纤维肿胀、断裂，肌细胞颗粒变性，出现空泡样变，部分区域局灶性坏死明显为重度改变;Ipost组可见间质轻度水肿，肌纤维轻度肿胀，有断裂，轻微肌细胞核固缩、肌浆凝集，未见明显坏死;PGE组间质水肿，肌纤维轻度肿胀，有断裂，轻微肌细胞核固缩、空泡变，肌浆凝集和点状坏死可见。见图1。表2 各组兔心肌Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶的活性

　　3 讨 论

　　在急性心肌梗死早期进行再灌注治疗，心肌保护作用远远超过再灌注损伤，若能在再灌注治疗中减轻再灌注损伤，理论上可以进一步改善患者的预后。2003年Zhao等〔4〕首先提出缺血后处理的概念，并证实其对再灌注后心肌具有保护作用，但这种保护作用的获得是以心肌细胞缺血为代价的，基于对缺血后处理保护机制的认识，人们推测某些药物能够通过促进内源性活性物质释放或直接作用于信号转导途径不同环节，模拟缺血后处理，即所谓的药物后处理。

　　I/R损伤过程中，中性粒细胞与血管内皮细胞(VEC)的黏附而外渗是启动炎症反应的关键步骤〔5〕，VEC上的sICAM1是介导中性粒细胞与VEC的黏附和浸润的重要黏附因子。MPO主要存在于中性粒细胞的嗜天青颗粒中,本实验通过测定心肌组织中MPO的活性，以反映中性粒细胞的浸润程度。本文结果提示，前列地尔后处理能够明显降低sICAM1蛋白表达，减轻中性粒细胞浸润，稳定细胞膜结构，对心肌的保护作用与缺血后处理相当。同时，电镜下前列地尔后处理组心肌结构损伤较I/R组明显减轻，进一步表明前列地尔后处理对心肌具有显著的保护作用。

　　Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶在生理条件下又称依赖ATP的膜结合蛋白酶，通过水解逆电化学梯度进行离子转运。两者对建立跨膜的离子梯度，维持细胞膜电位及细胞生理活动，并为其他离子和营养素的转运提供动力具有重要作用。I/R可显著抑制细胞膜ATP酶活性〔6，7〕。心肌再灌注损伤时，聚集、激活的中性粒细胞可阻塞微血管，造成再灌注早期的“无复流”，并通过呼吸爆发和脱颗粒作用释放大量的氧自由基(OFR)。细胞膜ATP酶受OFR攻击而活性下降，从而使Ca2+外流减少，内流增加〔8〕，氧化作用还使肌浆膜上Ca2+受抑，而阻止肌浆网自胞浆中摄Ca2+〔9〕。钙泵的调控失常不仅成为心肌I/R损伤时心功能异常和心律失常的分子基础，并终将引起心肌I/R损伤另一重要机制——细胞内Ca2+超载的发生及心肌细胞死亡。

　　本研究结果表明，前列地尔后处理对心肌细胞膜离子通道具有明显保护作用，其可能的机制是前列地尔能有效地抑制sICAM1蛋白表达，减少中性粒细胞的浸润，进而减轻氧自由基对细胞膜离子通道的损害，从而减轻了缺血心肌再灌注损伤。心肌I/R损伤的机制是多途径的，前列地尔后处理也可能通过各种不同的环节发挥心肌保护作用，保护细胞膜离子通道活性可能是其发挥心肌保护作用的机制之一。

　　【参考文献】

　　1 Lefer DJ,Scalia R,Campbell B,et al.Peroxynitrite inhibits leukocyteendothelial cell interactions and protects against ischemia reperfusion injury in rats〔J〕.J Clin Invest,1997;99(4)：68491.

　　2 刘 畅,陶贵周,李艳芹,等.前列地尔预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的心脏超微结构的保护作用〔J〕.解剖科学进展,2004;10(2)：1335.

　　3 于志泉,刘喜玲,王胜惠,等.前列地尔脂微球对急性前降支心肌梗死再灌注后心肌损伤的酶学影响〔J〕.中国急救医学杂志,2007;27(3):2834.

　　4 Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning〔J〕.AM J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285(2):57988.

　　5 Jordan JE,Zhao ZQ,VintenJohansen J.The role of neutrophils in myocardial ischemiareperfusion injury〔J〕.Cardiovasc Res,1999;43(4)：86078.

　　6 Inserte J,GarciaDorado D,Hernando V,et al.Ischemic preconditioning prevents calpainmediated impairment of Na+/k+ATPase activity during early reperfusion〔J〕.Cardiovasc Res,2006;70(2)：36473.

　　7 Temsah RM,Netticadan T,Kawabate K,et al.Lack of both oxygen and glucose contributes to I/R induced changes in cardiac SR function〔J〕. Am J Physiol Cell Physiol,2002;283(4)：130612.

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　　9 Netticadan T,Temsah R,Osada M,et al.Status of Ca2+/calmodulin protein kinase phosphoryletion of cardiac SR proteins in ischemia reperfusion〔J〕.Am J Physiol,1999;277(3)：38491.