缺血预处理时环磷酸腺苷含量及其依赖蛋白激酶活性的变化

　　作者：韩宏光,汪曾炜,张南滨,朱洪玉, 王辉山,姜辉    作者单位：沈阳军区总医院心血管外科，辽宁 沈阳 110016 　　【摘要】  目的：应用大鼠在体缺血/再灌注模型,探讨心肌缺血预处理程序（PC）中环磷酸腺苷 (cAMP)含量及cAMP依赖蛋白激酶(PKA)活性的变化及意义。方法：选择36只SD大鼠,进一步分为PC1-、2-、3-（缺血）组和PC1+、2+、3+（再灌注）组。用手术套管法造成左冠状动脉主干缺血及再灌注。损伤后取心脏用放射免疫法测cAMP水平,生化法测PKA活性变化。结果：心肌缺血预处理程序中cAMP含量及PKA活性随缺血及再灌注呈周期性波动。在5 min缺血预处理时表现为反复明显增高，而在间隔的再灌注程序中恰呈相反改变，明显下降。再预处理程序中， 5 min缺血期相对于同一周期中的5 min再灌注期，cAMP含量及PKA活性均有显著差异（P<0.01）。结论：cAMP及PKA的周期性波动变化可能是激发心肌缺血预适应（IP）的机制之一，cAMP可能在预处理保护作用中起重要作用。

　　【关键词】  缺血预处理；环磷酸腺苷；环磷酸腺苷依赖蛋白激酶

　　Changes of the content  of cyclic-AMP  and activity of protein kinase A during the procedure of  preconditioning

　　HAN Hong　guang, WANG Zeng　wei，ZHANG Nan　bin, ZHU Hong　yu，WANG Hui　shan， JIANG Hui

　　Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007,16(6):540

　　Abstract：Objective:To study changes of the content of cyclic-AMP (cAMP) and the activity of protein kinase A (PKA) during the procedure of preconditioning(PC) in rat myocardial in vivo.Methods:In this preconditioning procedure group, 36 SD rats were randomly further divided into PC1-，PC2-，PC3- group and  PC1+,PC2+，PC3+ groups, each group contained 6 rats. The 3 cycles of 5min ischemia were PC1-，PC2- and PC3-，the interval 5 min of interval reperfusion were PC1+，PC2+ and PC3+. Rats received surgical preparation and underwent left coronary artery occlusion and reperfusion. After the procedures, the hearts were isolated.The activity of PKA was analyzed  by method of biochemistry and the content of cAMP examined  by radioimmunoassay (RIA).Results:During the procedure of preconditioning， the content of cAMP and the activity of PKA varied with ischemia and reperfusion, presented marked fluctuation. Both indexes showed repeated significant increase when hearts exposed to three episodes of 5 min ischemia, and almost complete reversed by each reperfusion period,and  had significant difference ( P＜0.01) .Conclusion:The fluctuation of cAMP and PKA probably elicits the protection of ischemic  preconditioning. Ischemic preconditioning can afford some protection to heart through myocardial cAMP content.Author′s　address：Department of Cardiovascular Surgery，Shenyang Military District General Hospital,Shenyang,Liaoning，110016，China

　　Key words：Ischemic  preconditioning; Cyclic-AMP; Protein kinase  A    　　1986年,国外学者Murry在狗心脏实验中首次发现了心肌缺血预适应(ischemic  preconditioning,IP)现象,并将其定义为:反复短暂的心肌缺血/再灌注可以明显缩小其后长时间缺血所造成的心肌梗塞面积的大小,并改善心脏功能。IP对心肌的保护被认为是迄今为止最强的内源性保护,然而其确切机制至今未明。在保护机制中,IP的信号转导通路是目前研究的热点,其中包括环磷酸腺苷（cAMP）通路,但国内外对其研究较少[1] 。本研究应用大鼠在体缺血/再灌注模型,探讨心肌缺血预处理程序(PC)中cAMP含量及cAMP依赖蛋白激酶(PKA)活性的变化及意义，为进一步深入研究IP机制,从而为其应用于临床冠脉成形术及心外科手术奠定理论基础。

　　1  资料与方法

　　1.1  实验动物分组

　　健康雌性SD大鼠36只,体重270～320 g,由沈阳军区总医院实验动物中心提供。标准鼠食，自由取水，12 h光照、黑暗循环。按随机数字法将36只SD大鼠进一步分为PC1-，2-，3-，和PC1+，2+,3+组，每组n=6。其中3个周期5 min缺血示为PC1-，2-，3-;间隔的5 min再灌注示为PC1+,2+,3+。

　　1.2  实验试剂与仪器

　　主要试剂：cAMP放射免疫分析试剂盒(上海中医药大学同位素室),[γ-32P]三磷酸腺苷[（γ-32P）ATP］，北京福瑞生物工程公司，比活性37MBq/mmol)，PKA单克隆抗体(购于Santa  Cruz公司)，其余试剂均为国产分析纯。

　　主要仪器：动物人工呼吸机(浙江医科大学仪器实验厂,型号DH-140),Nihon Konden型心电图机(上海KONDEN医用电子仪器厂), 液闪计数仪(美国Backman LS5801)。

　　1.3  动物模型

　　大鼠经3%异戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉后,气管插管,呼吸机辅助呼吸(按1～1.5 ml/100 g体重潮气量,呼吸比为1.5∶1),接心电图肢体导联。沿胸骨左缘0.5 cm剪断第2、3、4肋骨,以手术线牵拉两侧肋骨暴露胸腔。破心包,以肺动脉圆锥与左心耳之间的左冠状静脉为标志,在左冠状静脉下缝线,线两端共穿一根聚乙烯小管以形成闭环。拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血,放松闭环即发生再灌注。实验中以左室前壁紫绀及同步心电图标导联S-T段抬高为结扎成功标志,对变化不明显者、穿线中大量出血者剔除实验。

　　1.4  指标测定

　　预处理程序每一时点的研究据图1,箭头所示为结束实验时间点，取出心脏后迅速置液氮保存备用。取出液氮保存的心脏,用冷生理盐水洗去血迹并于冰浴下分离剪碎心肌,然后置于6 ml 0.25 ml冷蔗糖缓冲液中,冰浴下用内切式匀浆器匀浆(6 000 r/min,20 s×3),所得匀浆先以5 000 g低温离心10 min,上清液在以40000 g低温离心20 min,取上清行cAMP含量及PKA活性测定。心肌cAMP含量测定：据放射免疫分析法(RIA法),按试剂盒说明书进行操作。PKA活性测定：反应总体积为50 μl，反应体系中含样品20 μl,0.5 mol/L Tris-Hcl(pH=7.5),10 mmol/L MgCl2,0.5 mg/mL 组蛋白，2 μmol/L[γ-32P]-ATP,30℃震荡反应7 min，取25 μ1反应液加在Whatman P81离子交换滤纸上(微孔直径0.45 μm)晾干，用75mmol/L磷酸洗3次，每次5 min，取出吹干，将滤膜加入含10 ml蒸馏水的液闪瓶中，以液闪计数仪测定其放射活性。

　　1.5  统计学方法

　　所有数据以均数±标准差(±s)表示,由沈阳军区总医院医学统计中心采用SPSS 10.0进行t检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2  结  果

　　心肌缺血预处理程序中cAMP含量及PKA活性的变化情况见表1。心肌缺血预处理程序中cAMP含量及PKA活性随缺血及再灌注呈周期性波动，在5 min缺血预处理时表现为反复明显增高，而在间隔的5 min再灌注程序中恰呈相反改变，明显下降（P<0.01）。表1  心肌缺血预处理程序（PC）中环磷酸腺苷（cAMP）含量及cAMP依赖蛋白激酶（PKA）活性的变化(略）注: PC1-∶PC1+,PC2-∶PC2+和PC3-∶PC3+,tcAMP值分别为6.06,6.56和7.24,tPKA分别为11.12,3.31和7.09,P均<0.01。

　　3  讨  论

　　心肌缺血预处理是迄今为止发现的对抗缺血损伤的最强的内源性保护。经过学者十几年的研究,发现IP的保护作用几乎在所有动物种属(包括人)中存在并得以证实。IP除有缩小心肌梗塞范围,还有抗心律失常、改善心脏功能等作用。对IP机制的深入研究无疑会增加对内源性心肌保护的理解,从而为临床应用奠定理论基础。本研究应用大鼠左冠状动脉主干反复缺血/再灌注制造出在体心肌缺血预处理模型。大鼠是心肌缺血/再灌注损伤模型中常用的实验动物, 具有心血管系统变异小,心血管系统解剖结构和冠脉支配区与人体相似,再灌注损伤出现几率高等优点,但造模难度高,尤其高位结扎左冠脉主干手术难度大,本实验中动物模型成功率仅在70%左右。

　　经典观点认为,心肌细胞膜上存在β-肾上腺素受体(β-AR)-腺苷酸环化酶（AC）系统,它的主要成分是β-AR、G蛋白、AC和cAMP。当激动剂与β-AR结合后,通过G蛋白偶联而激活AC,后者催化ATP生成cAMP。cAMP作为第二信使启动级联反应,产生一系列生理改变。本实验中心肌缺血预处理程序中，cAMP呈现明显周期性波动，在每周期的短暂缺血期间明显升高，在间隔的再灌注期可能由于血流的冲刷及酶活性改变，cAMP水平显著回落，升高与回落呈明显的周期性波动样改变。cAMP波动性变化是否是激发预处理的保护作用的因素呢?国外学者Loncbner[2]应用特异性受体激动剂及抑制剂，在离体大鼠心脏实验模型中模拟cAMP波动性变化，激发出心脏保护作用，从而间接证实cAMP周期性变化可能是激发IP保护作用的始动因素,说明cAMP在IP的作用中可能起重要的保护作用。

　　cAMP产生保护作用的可能机制为:(1)cAMP水平升高,可以激活PKA,PKA通过磷酸化胞膜L-型钙离子通道增加收缩期心肌细胞的Ca2+内流和肌浆网Ca2+释放,PKA可能参与IP的保护作用[2]；(2)通过cAMP依赖路径,可使细胞内Ca2+含量增加,Ca2+浓度增加可以刺激磷脂酶C(PLC),导致PKC通过二酰基甘油(DG)激活,而PKC是广泛被接受的参与保护作用的信号转导通路之一[3]。

　　cAMP水平增高可以激活PKA：尽管以前曾有关于心肌缺血时cAMP变化的报道，但本实验首次报道PC中cAMP含量、PKA活性及含量的变化。本实验证实PKA活性的变化与cAMP波动相似。只是PKA活性在PC前期尤其是PC1-较其他缺血程序有显著增高，而在PC1+又有较为明显回落；而cAMP则不然，它在PC后期PC3-、3+才有较前面程序的明显增高，两者差异的原因不明，仍需应用特异性抑制剂和激动剂进一步探讨。PKA在缺血预处理时从含量到活性都有明显增加，说明它参与IP保护作用的激发和中介。

　　PKA可能参与IP的保护作用，其可能机制:PKA调节肌浆网(SR)功能,而SR在调节细胞内Ca2+流动和心脏收缩-舒张过程中起重要作用。PKA使PLB磷酸化,从而减轻其对肌内质网钙离子ATP酶(SERCA2a)的抑制作用,导致SERCA2a对Ca2+亲和力增加,ATP水解增强[4]。PKA使PLB磷酸化后,可增大Ca2+摄取的最大速率,而已知短期Ca2+水平升高可以模拟IP的保护作用[5]。PKA激动可以完全不通过PKC而通过蛋白酪氨酸磷酸化[6],使p38-丝裂素激活蛋白激酶(p38MAPK)活性增强,通过热休克蛋白27(HSP27)转录、一氧化氮(NO)激活[7]等机制产生保护作用。

【参考文献】　　[1]Pagliaro P, Gattullo D,Rastaldo R,et al. Ischemic preconditioning: from the first to the second window of protection[J]. Life Sci,2001,69:1-15.

　　[2]Loncher A, Genade S, Tromp E, et al. Ischemic preconditioning and the β-adrenergic signal transduction path way[J]. Circulation，1999，100: 958-966.

　　[3]Brooks G, Hearse D. Role of protein kinase C in ischemic preconditioning: player or spectector[J]. Circ Res，1996，79 :6-7.

　　[4]Netticadan T,Temsah R, Osada M, et al.Status of Ca2+/calmodulin protein kinase phosphorylation of cardiac SR proteins in ischemia reperfusion[J]. Am J Physiol,1999, 277:384-391.

　　[5]Xu M, Wang Y,Hirai K,et al.Calcium preconditioning inhibits mito|chondrail permeability transition and apoptosis［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001, 280:899-908.

　　[6]Sanda S, Kitakaze M, Papst PJ,et al. Cardioprotection effect afforded by transient exposure to phosphodiesterase Ⅲ hibitors.The role of protein kinase A and p38 mitogen|activated protein kinase[J].Circulation,2001,104:705-710.

　　[7]Sanda S, Itakaze M,Papst PJ,et al. Role of phasic dynamism of p38 mitogen|activated protein kinase activation in ischemic preconditioning of the canine heart[J].Circ Res,2001,88:175-180.