静脉移植骨髓间充质干细胞治疗心肌梗塞的可行性研究

作者：要彤，何庚戌，张浩，胡盛寿，张晓玲，魏英杰    作者单位：1.北方学院第一附属医院心电图室，河北 张家口 075000；2.解放军第251医院胸心血管外科；3.中国协和医科大学、阜外心血管病医院、卫生部心血管疾病再生医学重点实验室         【摘要】  目的：探讨经静脉注射骨髓间充质干细胞（MSCs）对心肌梗塞大鼠模型心功能的影响及其在体内的分布情况。方法：在心肌梗塞后1周将标记的MSCs注射到大鼠舌下静脉内，在细胞移植后不同时间点取心、肝、脾、肺、肾脏器，进行组织学检查，观察移植细胞的分布。选取心肌梗塞模型大鼠通过心脏超声评价移植后3周、6周心功能改变情况。结果：静脉注射MSCs 后其组织结构未发现明显异常改变，早期主要分布在正常心肌组织内，1周后主要分布在梗塞及交界区内，正常心肌组织内很少见细胞存留。超声检查发现在细胞移植后实验组(12只）左心室没有进一步扩大，左心功能明显好于对照组（12只）：［左心室收缩末期内径（0.92±0.16）∶（1.078± 0.15）cm；左心室舒张末期内径（0.66±0.13）∶（0.79±0.11）cm；左心室短轴缩短率（28.4±4.2）∶（24.3±3.1）%；左室射血分数（52.7±4）∶（42.89±4.2）%，P均<0.05］。结论：静脉注射移植MSCs后细胞可以分布到重要组织器官内，移植细胞有向梗塞心肌组织内迁移的趋势，能明显延缓左心室重构及其所导致的心功能恶化。

        【关键词】  间质干细胞；心肌梗塞；干细胞移植

        Study of the feasibility of bone marrow MSCs injected through systemic vein to improve heart function after myocardial infarction /YAO Tong，HE Geng|xu,ZHANG Hao,HU Sheng|shou,ZHANG Xiao|ling,WEI Ying|jie//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2009，18（2）:142

        Abstract：Objective:To study the feasibility of  intraveinous injected  MSCs to delay heart function deterioration，and distribution of the transplanted cells in organs.Methods:Bone marrow MSCs were injected into the subglossal vein of the SD rats on  7th day after the myocardial infarction were created，and the organs such as lung，heart，liver，renal，spleen were harvested at different time after transplantation.In order to assess the efficiency of this approach of cell transplantation，24 SD rats were averagely divided into experiment group and control group,MSCs or medium was given.The diameters and function were evaluated through transthoracic echocardiography after 3 weeks and 6 weeks.Results:After injection,the MSCs could  distributed into the heart and nontargeted organ，such as spleen，renal，lung，but scarcely in the liver，the structure of these organs remain normal.The cells migrating into myocardium had a tendency to the infracted area.The left ventricle function did not exacerbate after injection of MSCs compared with control group［MSCs∶control:LVESd(0.92±0.16)∶(1.078± 0.15)cm；LVEDd(0.66±0.13)∶(0.79±0.11)cm；FS(28.4±4.2)∶(24.3±3.1)%；LVEF(52.7±4)∶(42.89±4.2)%，P<0.05  all］.Conclusion:The intravenously injection of MSCs is a feasible and safe approach to restore the heart function after MI.

        Author′s　address：The First Affiliated Hospital of North College,Zhangjiakou,Hebei,075000,China

        Key words：Mesenchymal stem cells；Myocardial infarction；Stem cell transplantation

        骨髓间充质干细胞(MSCs)具有容易获得和培养，无免疫原性，有向成肌细胞分化的潜能等多种优点，因此是细胞移植治疗缺血性心肌病的一种最有前途的细胞来源[1～5]。细胞移植途径是影响移植疗效和安全性的重要因素。在动物实验和临床试验中采用的细胞移植途径包括心肌内注射、经冠状动脉内注射、经冠状静脉窦移植等途径，而经静脉内移植，正如骨髓移植一样，由于可以反复、多次、大量进行无创的治疗，是最具有应用前景的治疗方法。本实验旨在研究静脉内注射MSCs到心肌梗塞大鼠体内后，移植细胞在体内各重要脏器的分布情况，以及对心脏功能的影响，进而探讨静脉注射MSCs治疗心肌梗塞的可行性及安全性。

        1  资料与方法

        1.1  MSCs的分离和培养

        大鼠腹腔注射苯巴比妥100 mg/kg，严格无菌条件下采取大鼠的胫骨和股骨，去除骨两端，用DMEM冲洗骨髓腔内的骨髓，将骨髓冲洗液进行离心，去除残渣。再用10ml含100 ml/L胎牛血清（FBS）的DMEM培养液接种于75 cm2培养瓶内。细胞融合达到70%～80％后进行传代。使用第3代细胞进行细胞移植。

        1.2  细胞标记及细胞悬液的制备

        用超顺磁性氧化铁颗粒进行细胞标记后，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，去除未进入细胞内的铁离子，以2.5g/L的胰酶消化细胞后制成细胞悬液。用200 μm 的滤网过滤细胞悬液，去除较大的细胞团块和残渣，用生理盐水将细胞制成106/ml的悬液。

        1.3  心肌梗塞模型的建立和细胞移植

        实验动物SD大鼠，以50ml/L异氟醚麻醉后气管插管接小动物呼吸机（Hovard Rodent 683，美国）。动物取第4肋间进胸，平左心耳结扎大鼠左侧冠状动脉，确认心肌梗塞范围，逐层关胸。术毕，肌肉注射青霉素（18000 U/kg），0.5 mg利多卡因，0.2 mg吗啡。

        心梗模型制作1周后，以胸超声进行筛选，入选标准：在左心室短轴切面上，左心室短轴缩短率(FS) < 35%。入选动物24只被随机分为对照组和细胞移植组（各12只）。入选大鼠腹腔内注射氯氨酮15 mg/kg，细胞移植组麻醉后经舌下静脉注射细胞悬液2 ml(2.0×106)，对照组注射等量生理盐水。

        1.4  超声心动图检查

        超声心动图仪采用Vivid 7(GE Vingmed Ultrasound，Horten，挪威)，10-MHz 探头。大鼠分别于心梗后1周（基准值）及接受移植手术后3周、6周分别检查一次。检查指标包括：左心室收缩末期内径（LVESd），左心室舒张末期内径（LVEDd），FS，左室射血分数（LVEF），由两位超声心动图医师采用单盲法进行图像分析。

        1.5  病理学分析

        分别在细胞移植后1d、7d、21d时处死大鼠5只，取心、肺、肝、肾、脾，石蜡包埋切片，进行普鲁士蓝染色,观察细胞在各组织脏器的分布情况以及脏器的结构变化。

        1.6  统计方法

        所有数据以平均值±标准差(±s)方式报告。统计软件采用 SPSS 11.0。三组之间数据比较用方差分析（ANOVA），最小显著差值法（LSD）法行组间比较。P<0.05为差异有显著性。

        2  结  果

        2.1  MSCs的分离和培养

        在大鼠骨髓腔冲洗出细胞种植后3 d，细胞进行换液，未贴壁的细胞随换液冲走。细胞呈纤维状，随着时间的延长，细胞集落不断向四周扩展，中央的细胞过于密集而失去纤细的细胞形态，细胞堆积，传代后可见细胞形态均匀一致，呈指纹样螺旋生长趋势。

        2.2  细胞的标记

        超顺磁性氧化铁颗粒可进入细胞浆内，普鲁士蓝染色可见胞浆内存在蓝染颗粒，细胞标记效率在95%以上。

        2.3  静脉内注射移植后MSCs在全身各主要脏器的分布

        2.3.1  心脏内的分布：在细胞移植后1d的组织切片中，心肌梗塞区域内的细胞数量相对较少（图1A），在梗塞心肌周边的新生血管内可见移植细胞存留（图1B），在梗塞周边可见大量移植细胞被扣留在正常心肌组织细胞之间（图1C）。在细胞移植后1周的组织切片，可见大部分存活的移植细胞在梗塞组织和正常组织的交界区域内（图1D），在细胞移植后3周移植细胞主要存留在心肌梗塞的组织内（图1E），而在正常的心肌组织内移植细胞数量相对很少（图1F）。

        2.3.2  在其他脏器的分布：肺脏组织内可见移植的MSCs在肺泡壁分布，参与了肺泡组织结构的构成，肺泡形态良好（图2A）；脾脏的皮质和髓质内均可见大量胞浆蓝染的移植细胞分布，移植细胞在脾脏内的分布数量最多（图2B）；肝脏组织内很少见有标记的细胞分布（图2C）；肾脏组织内可见有胞浆蓝染的细胞沿肾脏的肾小球动脉分布，在肾小管内很少见标记的移植细胞分布，肾小球形态正常，结构完整（图2D）。各组织器官的结构基本正常。

        2.4  静脉内细胞移植对心脏功能的影响

        对照组LVEDd、LVESd呈进行性增加，而LVEF、LVFS明显减低；细胞移植组LVEDd、LVESd与细胞移植前没有显著的差异（P=0.68），LVEF、LVFS并没有降低。细胞移植组和对照组在细胞移植后3周和6周时，LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS存在明显的差异，细胞移植组左心室扩大的程度明显小于对照组，左心室功能明显高于对照组（P<0.01），见图3。图1  静脉内细胞移植后在心肌梗塞组织的分布情况（普鲁士蓝染色） 注:与实验组比较△△P<0.01。

        3  讨  论

        细胞移植是近年来心肌损伤修复研究的一个热点问题。通过何种途径移植细胞到受损伤的心肌组织也是很多学者的研究方向。静脉注射细胞移植具有创伤小，可以反复多次进行移植的优点，故具有很大的吸引力。但由于培养的MSCs直径较大（约14～25μm），移植细胞能否顺利通过循环而到达靶器官，在体内的分布如何都是需要进一步研究的。

        Chen等[6,7] 的研究发现静脉内注射MSCs可显著改善中风大鼠的脑功能并促进其血管新生。而在Lange[8]的研究中发现通过颈动脉移植MSCs到缺血再灌注诱发的急性肾功能衰竭的大鼠动脉系统内也能明显促进大鼠肾功能的恢复。我们在实验中选择了心肌梗塞后1周作为细胞移植的时间点主要是由于梗塞区域早期的炎症性反应不利于细胞的存活，而在梗塞后1周左右炎症反应处于消退中，而梗塞区域很多细胞因子的表达也正处于高峰时期，利于移植细胞向受损伤的区域迁移[9]。我们发现移植早期细胞主要分布在正常的心肌组织内，只有少量的移植细胞分布在梗塞区域，而在1周后移植细胞大部分迁移到了梗塞的心肌组织内，在正常的心肌内存留的细胞数量很少。这些发现表明静脉注射移植的MSCs可以通过血液循环而到达梗塞的心肌组织内，并且在移植后会逐渐迁移到缺血梗塞部位来修复损伤的心肌组织。Kraitchman[10]在研究中通过静脉系统将MSCs移植到心梗动物体内，发现早期大量细胞被肺“俘获”，在移植后24h到7d可以在梗塞心肌组织内发现移植细胞分布。在很多实验中发现梗塞心肌局部表达很多细胞因子，尤其是对细胞迁移起重要作用的基质细胞衍生因子-1（SDF-1）。这些重要因子的表达可能是促使移植细胞向梗塞组织迁移的重要因素。

        肺脏是移植细胞首先要经过的脏器，在Gao[11] 静脉注射MSCs进行骨组织修复的研究中，发现移植后大部分细胞被肺血管所“俘获”，移植之前首先给予静脉注射硝普钠等血管扩张药物会明显减少细胞在肺组织内的存留。本研究同样发现细胞移植后大量的移植细胞分布在肺脏，并可见移植细胞参与了肺泡壁的结构，但肺泡的形态未发生病理性改变。脾脏内可见有大量的移植细胞分布在脾脏的皮质和髓质内，在Barbash[12] 的研究中同样发现脾脏是移植细胞数量最多的组织器官，而且经心室内注射较静脉注射脾脏聚集的移植细胞数量更多，由于脾脏是体内清除异体组织的重要脏器，因此脾脏可能是移植细胞通过血液循环向梗塞心肌组织定向迁移的又一障碍。在肾脏可见移植细胞主要沿肾小球动脉分布，很少有移植细胞分布在肾小管内。在肝脏组织内则只有极少的移植细胞存留、分布。

        MSCs经静脉系统注射后不仅有大量细胞分布到心肌梗塞区域，而且还能够显著地保护心脏功能，通过某种机制延缓了梗塞后左心室的重构。在细胞移植组左心室直径没有进行性增大，LVEF、FS没有进行性下降，而对照组在梗塞后3周、6周，左心室直径进行性增加，左心室功能进行性下降。3周、6周时实验组和对照组左心室腔和心功能有显著的差异。大量动物实验和临床试验证明，通过冠状动脉内或心肌内注射移植能够明显改善心肌梗塞后心脏的功能，细胞移植改善心脏功能可能的机制包括移植细胞在梗塞心肌内形成有收缩力的心肌，重塑梗塞部位心肌的组织成分，阻止心室重构，血管新生、旁分泌等作用。我们在实验中发现移植细胞静脉注射后可以顺利通过肺脏而达到心脏，并逐渐迁移到梗塞部位，为梗塞组织的修复提供了重要基础，也证明此种治疗途径是安全可行的。

        【参考文献】        ［1］Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium［J］.Nature.2001;410:701-705.

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        ［6］Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats [J].Stroke，2001,32:1005-1011.

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