黄芪总黄酮对豚鼠心室肌细胞ATP敏感的钾电流的作用
发表时间：2010-02-24 浏览次数：556次
黄芪总黄酮对豚鼠心室肌细胞ATP敏感的钾电流的作用作者：包吉日木图 赵明 包伍叶 作者单位：通辽，内蒙古民族大学附属医院心内科 【关键词】 黄芪总黄酮 豚鼠 心室肌细胞 ATP敏感的钾电流 中药黄芪具有显著的益气强心作用。在临床上除了用于治疗冠心病心绞痛外,还能够治疗高血压、低血压、病毒性心肌炎、肾炎、脑梗死、心律失常等［1］。现代药理研究分析，黄芪的化学成分主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类以及氨基酸类等。黄酮的不同化学成分，具有不同的药理活性。黄芪总黄酮(total flavonoids of astragalus, TFA)是从豆科类植物黄芪中分离出来的有效活性成分，实验表明它具有清除多种自由基的功效，并且对自由基所致细胞膜蛋白质以及DNA损伤有保护作用［2］ 。 ATP敏感的钾电流（ATP sensitive potassium current，IKATP）广泛分布于心肌,在心肌内层细胞呈高密度分布。IKATP具有内向整流特性,电导性强,其活性受细胞内外不同因素调节。确定IKATP的标准为:钾通道的活化不依赖于膜电位的改变,却可被胞内ATP所抑制;可被二磷核苷酸(NDPs)、K通道开放剂所激活,而被格列本脲等特异性抑制剂所抑制。心肌细胞对缺血缺氧呈现多种反应,其中包括IKATP开放,这是机体防御心肌缺血损害的重要机制之一［3］。文献报道，黄芪具有明显抗心肌缺血的作用，但机制不明［45］。本研究旨在用全细胞膜片钳技术观察TFA对豚鼠心室肌细胞IKATP影响,以全面了解TFA抗心肌缺血作用机制。1 材料和方法 1.1 实验材料 TFA由内蒙古民族大学有机化学实验室提供，豚鼠（雌雄不拘重300～350 g）由内蒙古民族大学基础医学院动物中心提供。 1.2 溶液配制 (1)有钙台氏液（mmol/L）：NaCl 143，KCl 5.4，CaCl2·2H2O 1.8，MgCl2·6H2O 0.5，NaH2PO4·2H2O 0.25，HEPES 5；用NaOH将pH调至7.4。无钙台氏液（mmol/L）：NaCl 143，KCl 5.4，MgCl2·6H2O 0.5，NaH2PO4·2H2O 0.25，HEPES 5；用NaOH将pH调至7.4。 贮存液（mmol/L）：KOH 70，Lglutamic 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO4 20，MgCl2·6H2O 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 1.5，用KOH将pH调至7.4。酶溶液：无钙台氏液+0.4 mg/ml collagenase+0.1 mg/ml protease。(2)记录ATP敏感的钾通道IKATP电极内液(mmol/L) : KCl 140, MgCl2 1,CaCl2 22, CdCl2 0.3, TTX 0.001, HEPES 10,pH 7.3。细胞外液：KCl 120, KOH 20, EGTA 5, MgCl2 1, TTX 0.001, HEPES 10。(3)TFA按20 mg/kg体重加蒸馏水制备成溶液备用。 1.3 豚鼠心室肌细胞急性分离方法 急性处死豚鼠后，迅速开胸取出心脏，置于冰冷有钙台氏液中。行主动脉插管后固定于Langendorff 灌流架上逆向灌流心脏，依次使用有钙台氏液1.5 min，无钙台氏液6 min，酶溶液13 min，贮存液3 min。灌流完毕后，沿房室沟处剪下心室部分，用眼科剪将心室肌剪成小碎块，置于盛有贮存液的三角烧杯中，于37 ℃的水浴箱中轻轻振荡10 min，吸取上清液置于离心管中，离心5 min后弃上清液，加入贮存液，于4 ℃的冰箱中保存备用。 1.4 实验分组及数据的采集和处理 随机选取心室肌细胞分为正常对照组、TFA 20 A.对照组; B. TFA组 图1 TFA对豚鼠心室肌细胞IKATP的影响mg/kg体重组。在实验中，应用Pclamp 6.0 程序中的Clampex 程序记录出原始的心室肌细胞全细胞膜电流图形，再应用Pclamp 9.0程序中的Clampfit程序对心室肌细胞IKATP的全细胞膜电流做统计分析。 1.5 统计学处理 计量资料用均数±标准差（±s），用SPSS 11.0统计软件进行数据统计，各组之间的数值比较采用样本均数t检验进行统计学分析。P<0.05认为差异有统计学意义。2 结果 TFA对豚鼠心室肌细胞IKATP的作用，采用全细胞膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞IKATP，将保持电位控制在-40 mV使Na+通道失活，电极内液中加入的CdCl2具有阻断钙电流的作用，测试电位从-100 mV到+100 mV，阶跃命令为10 mV，时程300 ms，在无缺血、缺氧及代谢受抑制的情况下，一般记录不到IKATP通道的开放，这与文献报道相符。观察封接成功的正常豚鼠心室肌细胞，未发现具有IKATP通道特征的电流活动。而在模拟缺血液灌流30 min后，可引出一外向电流,其原始电流曲线，此电流能部分地被Glinbenclamide 所抑制，证实为IKATP通道电流。将每一脉冲末期记录到的电流对应电压做图，得到电流电压关系（IV）曲线，IV曲线与X轴相交的电压值即为翻转电位，加入TFA后与对照组比较, IKATP峰值从（0.63±0.38） nA增加到(1.12±0.53) nA，差异有统计学意义 (P<0.01，n=6) 。见图1、2。 图2 TFA对豚鼠心室肌细胞IKATP IV曲线的影响3 讨论 心肌细胞对缺血缺氧呈现多种反应,其中包括IKATP开放,这是机体防御心肌缺血损害的重要机制之一。IKATP参与机体心肌缺血预适应反应(myocardial ischemic preconditioning)，心肌缺血预适应能减轻心肌缺血的继发性损害。文献报道，促进IKATP开放的药物可减轻心肌细胞缺血的继发性损伤，而阻断IKATP的药物，如格列本脲则能加剧心肌缺血,增加梗死面积［6］。人体心肌的缺血预适应机制也可能通过开放IKATP得到调节［7］。IKATP通道开放剂的心脏保护作用,有利于心肌细胞度过代谢危急状态。IKATP同时增加心肌氧供,减少氧耗,改善心脏功能。心肌缺血时,缺血区供氧与耗氧严重失衡,继而导致IKATP激活,引起冠脉及其侧支血管扩张,以增加缺血区血液供应。IKATP开放产生负性肌力作用,缺血心肌收缩性能迅速降低,心肌耗氧量下降,从而保护心肌免遭更严重的缺血性损伤。格列本脲阻断IKATP而增加心肌顿抑的危险, 促进IKATP开放的药物能减少心肌顿抑的危险,呈现改善顿抑心脏局部心肌收缩功能和改善心肌局部血流动力学的作用［8］。 本研究观察到TFA可显著增加豚鼠心室肌细胞IKATP。这一实验结果可以很明确解释黄芪抗心肌缺血作用机制，黄芪是通过以下几个途径实现抗心肌缺血作用的：（1）TFA通过促进IKATP开放来减轻心肌缺血的继发性损害，缩小心肌梗死面积。（2）TFA通过促进IKATP开放引起冠脉及其侧支血管扩张,以增加缺血区血液供应。（3）IKATP开放产生负性肌力作用,缺血心肌收缩性能迅速降低,心肌耗氧量下降,从而保护心肌免遭更严重的缺血性损伤。【参考文献】［1］周吉燕,樊懿,孔建龙，等.黄芪中不同提取成分对在体豚鼠心肌缺血再灌注损伤的心功能影响.中国中药杂志，2000，25：301302.［2］王立云. 黄芪的化学成分及其药理作用. 中国社区医师，1999，10：4850.［3］张峰，梅其炳.ATP敏感的钾通道与预适应心肌保护作用.生理科学进展，2002，33：148150.［4］雷春利,陈羽,吕文伟,等. 黄芪总皂苷对犬急性心肌梗死缺血面积、心外膜电图、心肌酶的影响. 白求恩医科大学学报, 1995, 21:111.［5］石刚刚, 陈锦香, 李长潮, 等. 黄芪注射液对冠状动脉直接作用的研究. 中药新药与临床药理, 1999, 10:38.［6］Thornton JD, Rohmann S. Blockade of ATPsensitive potassium channel,increases infarct size but not prevent preconditioning in dogs.Basic Res Cardiol, 1994,89:563576.［7］Carr CS,Grover GJ,Pugsley WB,et al. Comparison of theprotective effects of a highly selective ATPSensitive potassium channel opener and ischemic preconditioning in isolated human atrial muscle.Cardiovasc Drugs Ther, 1997,11:473478.［8］Fujita M. Salutany effects of myceardial ischemia in coronary anteny disease.Int J Cardiol, 1995,52:197202.
