小檗碱对2型糖尿病大鼠肺泡和腹腔巨噬细胞氧化低密度脂蛋白及脂蛋白脂酶的影响

小檗碱对2型糖尿病大鼠肺泡和腹腔巨噬细胞氧化低密度脂蛋白及脂蛋白脂酶的影响作者：高清源 陈三妹    作者单位：湖南常德职业技术学院护理系 浙江省绍兴文理学院医学院     【摘要】  目的 探讨小檗碱对2型糖尿病大鼠血脂及肺泡和腹腔巨噬细胞氧化低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein,oxLDL）、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)表达的影响。方法 SD大鼠分4组，正常对照组、高脂组、糖尿病组、小檗碱治疗组，治疗结束后测定各组大鼠血清葡萄糖、胰岛素和血脂含量，并检测肺泡巨噬细胞和腹腔巨噬细胞oxLDL含量和LPLmRNA的表达水平。结果 (1)小檗碱对糖尿病大鼠具有降低血糖、胰岛素水平和调节脂代谢紊乱等作用；(2)经小檗碱治疗后糖尿病大鼠肺泡和腹腔巨噬细胞oxLDL含量下降, LPL mRNA表达降低。结论 推测小檗碱对糖尿病大鼠的治疗作用可能与提高胰岛素敏感性，降低巨噬细胞oxLDL、LPL表达有关。     【关键词】  小檗碱； 糖尿病，2型； 脂蛋白脂酶     Effect of berberine on the expression of oxLDL，LPL in alveolar and peritoneal macrophages in diabetic rats  GAO　Qingyuan*， CHEN Sanmei.　*Department of Nursing, Changde Vocational Technical College，Changde　415000, China    【Abstract】  Objective  To study the effect of berberine on the expression of oxLDL，LPL in alveolar and peritoneal macrophages in type 2 diabetic rats.Methods  SpragueDauley rats were divided into four groups: normal control group, high fat diet group, type 2 diabetes group and berberine treatment group. After treatment, serum glucose, insulin and lipid concentration were measured in different rats' groups. Then the level of oxLDL and LPL mRNA expression were detected in the alveolar macrophage （AM） and peritoneal macrophage （PM）. Results  The levels of serum glucose, insulin and lipid in type2 diabetic rats were decreased by berberine treatment. In the treatment groups, the level of oxLDL and LPL mRNA expression were reduced in AM and PM.Conclusion  Berberine can enhance the sensibility of serum insulin and reduce the level of LPL expression in macrophage, which may be beneficial to diabetes.    【Key  words】  Berberine；  Diabetes mellitus, type 2；  Lipoprotein lipase    糖尿病与动脉粥样硬化关系密切，表现为糖尿病患者出现动脉粥样硬化的时间早、程度重和预后差。近年的研究提示，2型糖尿病和动脉粥样硬化可能是同一个病理基础上平行发展的两个疾病［1］。在病变的发生发展过程中，单核／巨噬细胞源性泡沫细胞形成起着重要作用。故本实验以巨噬细胞为着眼点，通过小檗碱干预，观察小檗碱对2型糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）及腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophage，PM）内氧化低密度脂蛋白（oxLDL）含量和LPL基因表达以及血脂、血糖和血胰岛素水平的影响，为小檗碱治疗糖尿病及其心血管并发症防治机制的研究提供实验基础。   1  材料和方法    1.1  动物模型建立和处理    清洁级雄性SD大鼠54只（温州医学院实验动物中心提供），体重250～300 g，随机分成４组：正常对照组、高脂组、糖尿病组、小檗碱治疗组。后３组喂以高糖高脂饲料（饲料组成：10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，66.5%常规饲料）１个月，诱发胰岛素抵抗；糖尿病和治疗组大鼠在禁食12 h后按30 mg/kg腹腔注射链脲佐菌素(Sigma公司产品，溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液内，pH 4.0)，注射后72 h测血糖，≥13.8 mmol/L为造模成功。对照组腹腔注射等容积柠檬酸缓冲液。此后，治疗组大鼠给予小檗碱(东北制药总厂，批号20040807）灌胃治疗，因小檗碱难溶于水，故予小檗碱+2％羧甲基纤维素钠+蒸馏水混合制成小檗碱混悬液，按100 mg/kg小檗碱灌胃，每天１次；对照组、高脂组及糖尿病组灌胃等容积2％羧甲基纤维素溶液，每天１次，连续12周。    1.2  指标测定    1.2.1  血糖、胰岛素和血脂含量测定  股动脉放血处死大鼠，取血3 ml，室温凝固25 min，1500 r/min离心20 min，分离血清，分别测定血糖、胰岛素和血脂含量。    1.2.2  AM和PM的灌洗和培养  见参考文献［2］。    1.2.3  oxLDL含量测定  采用双抗体夹心ELISA法分别检测AM和PM的oxLDL含量。    1.2.4  LPL mRNA表达的测定  取上述培养的AM和PM，用PUREScript试剂盒提取总RNA，用软件Primer 6.0设计引物（表1）。以βactin基因为内参照，进行LPL的RTPCR扩增。琼脂糖凝胶电泳30 min后，ImagemasterVDS成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件（TolallabV101）进行灰度扫描分析。以目的基因与βactin的PCR产物条带灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。    1.3  统计学处理    计量资料用均数±标准差（±s）表示。用SPSS 11.0统计软件进行数据统计，组间比较用方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。2  结果    2.1  血糖、胰岛素、血脂检测结果    与正常对照组相比，糖尿病组大鼠血糖、胰岛素水平、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC)明显升高(P<0.01)，高密度脂蛋白胆固醇（HDLC)下降（P<0.01）；经小檗碱治疗后，糖尿病组大鼠血糖、胰岛素降低(P<0.05)，TC、TG降低(P<0.01)，LDLC也降低(P<0.05)。HDLC有升高趋势，但差异无统计学意义。表明：小檗碱可明显改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢异常和胰岛素抵抗。见表2。    糖尿病大鼠AM和PM内oxLDL浓度明显升高（P<0.01），经小檗碱治疗后，AM内oxLDL浓度降低（P<0.05），PM内oxLDL浓度明显降低（P<0.01）。见表3。注：与正常对照组比较，aP<0.05， bP<0.01；与糖尿病组比较，cP<0.05，dP<0.01浓度测定结果比较注：与正常对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与糖尿病组比较，cP<0.05，dP<0.01表达结果比较  注：与正常对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与糖尿病组比较，cP<0.05，dP<0.01    2.2  肺泡巨噬细胞和腹腔巨噬细胞LPL的基因表达水平    糖尿病大鼠AM和PM内LPL的mRNA表达水平升高（P<0.01），经小檗碱治疗后，LPL mRNA在PM表达降低(P<0.05)，在AM中表达差异无统计学意义。高脂组上述指标有升高趋势，但无统计学意义。见表4，图1。    M.标准参照物；1.正常对照组； 2.高脂组； 3.糖尿病组；4. 小檗碱治疗组3  讨论    小檗碱(Berberine)又名黄连素,是黄连所含的有效生物碱，以它的抗菌、抗病毒等作用的治疗报道甚多，近些年来发现小檗碱具有降血糖作用。倪艳霞等［3］于1988年首先报道口服黄连素在临床上可治疗2型糖尿病，黄连素作为一种药效温和、安全有效、经济方便、副作用少的天然药物，在治疗糖尿病及其并发症的防治方面有着非常广阔的应用前景。本课题组率先研究小檗碱对糖尿病时AM和PM功能状态的影响，为进一步深入探讨小檗碱治疗糖尿病及其并发症机制提供依据，从而寻求糖尿病防治途径。    LPL是一种肝外酶,由实质细胞粗面内质网合成,在体内分布广泛,主要在骨骼肌、心肌和脂肪组织表达。胰岛素可以通过提高LPL mRNA的水平加快LPL的合成速度,从而增强LPL的活性。研究显示,胰岛素抵抗患者的骨骼肌中,LPL的活性下降,提示胰岛素调节LPL活性的能力受损［4］。因此发生胰岛素抵抗时,LPL的活性下降并大量堆积,影响了正常脂蛋白的代谢速度,使LDL的清除速率下降，oxLDL是LDL的氧化产物，巨噬细胞吞噬oxLDL,形成泡沫细胞,同时平滑肌细胞向内膜移行和增殖、血小板在血管壁黏附和聚集,最终形成脂质斑块。oxLDL通过多种途径启动和促进动脉粥样硬化发展，在糖尿病动脉粥样硬化的发展进程中起关键作用［5］。近来有资料提示，糖尿病引起动脉粥样硬化与巨噬细胞过度表达LPL有关。 LPL在调节体内三酰甘油代谢和血浆脂蛋白中发挥重要作用，组织LPL高度表达可直接导致胰岛素抵抗。进展期粥样斑块中含大量巨噬细胞样细胞，LPL活性明显增高。血管壁中巨噬细胞产生LPL，使脂质积聚于动脉壁内，促进动脉粥样硬化发展［6］。故LPL与糖尿病动脉粥样硬化的关系密切。Sartippour等［6］用2型糖尿病患者单核细胞进行体外培养，证明患者血清中存在LPL合成增加调节因子，在J774巨噬细胞体外培养实验中用高浓度葡萄糖刺激，细胞LPL mRNA表达明显增加。    本研究发现，糖尿病组大鼠血糖、胰岛素水平、TC、TG、LDLC明显升高(P<0.01)，HDLC下降（P<0.01）。表明本实验成功复制了2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及糖、脂代谢紊乱的模型。糖尿病组大鼠肺泡和腹腔巨噬细胞oxLDL水平及LPLmRNA表达较正常对照组明显增强。运用小檗碱干预后发现，糖尿病组大鼠血糖、胰岛素降低，TC、TG降低，LDLC也降低。AM和PM oxLDL含量下降,PM LPL mRNA表达下降，PM LPL mRNA表达有下降趋势，但无统计学意义，提示小檗碱具有调节糖、脂代谢紊乱的作用并可影响糖尿病及其大血管病变的发生、发展。其作用机制可能是其可以通过降低LPL mRNA的表达来改善胰岛素抵抗，从而进一步降低oxLDL水平及LPL mRNA的表达。【参考文献】［1］Lyon CJ,Law RE,Hsueh WA. Minireview: adiposity, inflammation, and atherogenesis.Endocrinology,2003,144:21952200.［２］陈国荣,金丽琴,邵黎明,等.实验性糖尿病大鼠巨噬细胞内酶活性及吞噬功能的研究.免疫学杂志, 2000,16:352354.［３］倪艳霞,刘安强,高云峰,等.黄连素治疗Ⅱ型糖尿病60例疗效观察及实验研究.中西医结合杂志，1988，8:711.［４］Panarotto D, Remillard P,Bouffard L, et al.Insulin resistance affects the regulation of lipoprotein lipase in the postprandial period and in an adipose tissuespecific manner. Eur J Clin Invest, 2002,32:8492.［５］Ehara S, Ueda M, Naruko T, et al. Pathophysiological role of oxidized lowdensity lipoprotein in plaque instability in coronary artery diseases. J Diabetic Complications, 2002，16:6064.［６］Sartippour MR, Lambert A, Laframboise M, et al. Stimulatory effect of glucose on macrophage lipoprotein lipase expression and production.Diabetes, 1998,47:431438.