高血压大鼠左室重构时Toll样受体4的表达及作用

高血压大鼠左室重构时Toll样受体4的表达及作用作者：姜华 曲鹏 王纪文 李贵华    作者单位：大连医科大学附属第二医院心内科     【摘要】  目的 探讨Toll样受体4（toll like receptor 4, TLR4）在高血压大鼠左室重构中的表达及作用。方法 健康雄性spraguedawley(SD)大鼠6～8周龄，体重160～190 g。采用两肾一夹法建立Goldblatt鼠模型，45只SD大鼠随机分为高血压组（25只）和假手术组（20只）。每周测1次尾动脉压，每两周测1次超声心动图。术后第8周，应用RTPCR及Westernblot从mRNA及蛋白水平检测左室心肌TLR4的表达情况；放免法检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的含量。结果 与假手术组相比，术后8周高血压组尾动脉压、收缩末期经线室壁应力（Meridional endsystolic wall stress,MESS）及左室重量指数（left ventricle mass index,LVMI）、相对室壁厚度（relative wall thickness,RWT）和心肌AngⅡ含量均明显增高（P<0.01）；高血压组大鼠左室心肌组织中TLR4 mRNA及蛋白表达水平也明显升高（P<0.01）。相关性分析TLR4蛋白表达与LVMI、RWT呈正相关；同时与动脉压、MESS及局部AngⅡ含量相关。结论 高血压左室重构时TLR4表达明显增高，表明TLR4及其介导的免疫、炎症反应可能参与高血压左室重构的发生发展，持续的压力负荷及心肌局部AngⅡ含量可能对左室心肌TLR4表达起到重要调节作用。     【关键词】  高血压； 心室重构； Toll样受体     Expression and function of Tolllike receptor 4 (TLR4) in hypertensive left ventricular remodeling  JIANG Hua, QU Peng, WANG Jiwen, LI Guihua. Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, China   Corresponding author: QU Peng, Email: qupeng777@yahoo.com.cn    【Abstract】  Objective  To investigate the expression and function of Tolllike receptor 4 (TLR4) in hypertensive left ventricular remodeling. Methods  The Goldblatt model of twokidney oneclip (2K1C) renovascular hypertension was induced in fortyfive male SpragueDawley rats. They were randomly divided into hypertension group (group H, n=25) and sham operation group (group C, n=20). The caudal arterial pressure was measured once a week and echocardiogram was examined every two weeks. The concentration of AngII in left ventricle was measured by radioimmunoassay, and western blotting and RTPCR were used to examine the mRNA and protein expression of TLR4 in the left ventricle eight weeks after operation. Results  Compared with group C, the caudal arterial pressure, meridional endsystolic wall stress (MESS), left ventricle mass index (LVMI), relative wall thickness (RWT) and the concentration of Ang Ⅱ were significantly increased in group H eight weeks after operation (P<0.01). TLR4 mRNA and protein expression in the left ventricle were obviously higher in group H (P<0.01). Positive correlations were observed between the protein expression of TLR4 and LVMI, RWT.  Conclusion  The expression of TLR4 is significantly increased in hypertensive left ventricular remodeling. Enhanced expression of TLR4 and its mediated immunoinflammatory reactions contribute to the development of hypertensive left ventricular remodeling. Sustained pressure overload and the concentration of Ang Ⅱ may induce the expression of TLR4 in left ventricle.    【Key  words】  Hypertension;  Ventricular remodeling;  Tolllike receptors    左室重构是高血压最常见的并发症，已被公认是与病死率密切相关的独立危险因子，也是心力衰竭发生发展的基本机制。目前虽有研究显示，炎症与高血压心脏重构有密切关联，但仍需要足够的证据和深入探索。Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）是近年克隆出来的与免疫、炎症密切相关的跨膜信号转导受体家族（Toll）成员之一，在心肌细胞中有较高水平表达［1］。研究者注意到发生梗死后重构的鼠心肌和特发性扩张型心肌病患者的心肌组织中TLR4的表达上调；TLR4基因缺陷鼠梗死后心肌重塑及心脏功能较TLR4基因正常鼠明显改善［12］。因此设想TLR4及其介导的信号通路，可能通过激活心肌中的免疫机制和炎症反应，参与左室重构的形成和发展。目前有关TLR4的研究主要集中于病毒性心肌炎、脓毒症、脓毒症休克、动脉粥样硬化等与感染、炎症密切相关的心血管疾病，那么在无明显感染证据的高血压左室重构过程中，是否也存在TLR4的识别介导作用，仍需进一步探索。本实验采用Goldblatt大鼠高血压模型，观察左室重构心肌中TLR4表达及其与压力负荷、左室结构、左室心肌血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, AngⅡ）含量的相互关系，初步探讨TLR4在高血压左室重构发生与发展中的作用。1  材料和方法    1.1  实验动物与主要试剂    健康雄性spraguedawley(SD)大鼠，6～8周龄，体重160～190 g，由大连医科大学动物实验中心提供。AngⅡ放免试剂盒购自北京海科锐放免研究中心。羊抗鼠TLR4多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，SP免疫组化试剂盒购自北京中山生物试剂公司。RTPCR试剂盒：Takara产品，DRR024A。两肾一夹（2K1C，Goldblatt）大鼠高血压模型的复制及分组［3］：术前所有大鼠测量体重（body weight,BW）、基础尾动脉压及行超声心动图检查，4%水合氯醛麻醉后, 打开腹腔，用内径0.3 mm的银夹钳夹左肾动脉并造成其部分狭窄，术后2周尾动脉压升至150 mmHg以上的25只大鼠入选（高血压组），同时另外20只大鼠行同样的手术但不放置银夹（假手术组）。术后各组大鼠每周测1次尾动脉压，每两周行1次超声心动图检查。    1.2  心脏结构指标的检测［3］    各组大鼠在吸入20%乙醚麻醉状态下行超声检查，探头频率为11 MHz，取左室(left ventricular，LV)长轴切面二尖瓣尖水平，在二维影像指导下M型超声测量收缩末期及舒张末期左室内径(LVD)、左室后壁厚度(LVPW)、室间隔厚度(IVS)，分别取其连续5次心动周期平均值。计算左室重量（LV mass,LVM）、左室重量指数（LV mass index，LVMI）、相对室壁厚度（relative wall thickness，RWT）及收缩末期经线室壁应力(meridional endsystolic wall stress，MESS)。    1.3  左室心肌AngⅡ含量测定    放射免疫法，按试剂盒要求操作。    1.4  左室心肌组织中TLR4 mRNA的检测    100 mg心肌组织剪碎后加入1 ml TRIzol，按TRIzol Regeant说明书提供的方法提取总RNA，应用核酸测定仪测得A260/280=1.88±0.26。TLR4上游引物为：5′CGCTTTCAGCTTTGCCTTCATTAC3′,下游引物为：5′AGCTACTTCCTTGTGCCCTGTGAG3′，扩增的片段为555 bp。内参βactin上游引物为5′AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG3′,下游引物为5′TCATGAGGTAGTCTGTCAT3′扩增的片段为241 bp。RTPCR一步法反应条件50 ℃ 30 min,94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 70 s,72 ℃ 90 s,30个循环；最后72 ℃延伸10 min。RTPCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳。应用计算机凝胶扫描成像系统采集电泳结果，并分析目标条带与内参条带灰度比值作为基因表达的相对含量，进行半定量分析。    1.5  Westernblot法检测心肌中TLR4的表达    取心肌组织100 mg，应用细胞裂解液（50 mmol/L TrisHCl(pH 8.0),150 mmol/L NaCl,1% TritonX100, 15 mmol/L EDTA,10 mmol/L PMSF）提取总蛋白并定量，取样品50 μg行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳后的SDSPAGE凝胶浸于转移缓冲液中30 min，进行半干式电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h。封闭后NC膜与TLR4一抗反应（一抗用封闭液稀释200倍），4 ℃过夜。TTBS洗，10 min×3次。NC膜与生物素标记的二抗结合，37 ℃静置30 min，TTBS洗，10 min×3次。NC膜与辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素结合，37 ℃静置20 min，TTBS洗，10 min×3次。将NC膜浸于DAB显色液中，观察有清晰的特异条带出现时，用大量的水冲洗NC膜以终止显色反应。应用计算机Westernblot印迹分析软件，测出各条带的A值。    1.6  统计学方法    应用SPSS 10.0统计软件进行数据分析。数据处理：实验结果以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验分析，各参数之间的相关性用直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。注：与假手术组比较,aP＜0.05, bP＜0.012  结果    2.1  大鼠尾动脉压及心脏结构的变化    术前各组大鼠之间的SBP及心脏超声检查各指标差异均无统计学意义(表1)。术后8周高血压组SBP、LVMI、LVPWD、RWT及MESS较假手术组明显升高（P<0.01）(表2)。同时也检测了术后8周各组大鼠心肌组织中AngⅡ含量，发现高血压组显著高于假手术组(P＜0.01)。    2.2  左室心肌中TLR4表达    2.2.1  TLR4 RTPCR结果  所有大鼠心肌组织中均表达TLR4 mRNA，每份样本结果以目的基因TLR4条带与内参βactin条带灰度比值作为该样本TLR4 mRNA表达的相对含量。统计分析表明：与假手术组相比，高血压组TLR4 mRNA水平增加了1.72倍（A值0.523±0.124比0.915±0.243,P＜0.01)，见图1。　　2.2.2  TLR4 Westernblot结果  所有大鼠心肌组织中均有TLR4蛋白表达。每个样本以其条带的A值为该样本TLR4表达的相对含量。统计分析表明，高血压组TLR4蛋白表达较假手术组增加了1.60倍（A值0.552±0.197比0.345±0.116,P＜0.01）。3  讨论    1997年，Medzhitov等［4］首先发现了人类与免疫炎症密切相关的信号转导受体Toll蛋白，即TLR4。目前已证实TLR4是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）信号向细胞内传导的门户蛋白。TLR4活化后可以触发细胞内几条信号传导途径，在这些途径中最重要的就是核转录因子（NF）κB的激活，从而调节一系列与心血管病理生理相关的靶基因，包括细胞因子［TNF,interleukin（IL）1,IL6,interferon (IFN)γ］、化学因子、白细胞黏附分子以及调节细胞增殖、细胞存活的基因的转录［5］。Thomas等［6］在烧伤后心力衰竭的小鼠模型研究中发现，无TLR4表达的小鼠(基因缺失或突变)心力衰竭的发生率明显低于TLR4正常的小鼠；TLR4基因型多态性与血管炎症、冠心病相关联［7］；需要置入左室辅助设施的心力衰竭患者心肌TLR4表达明显增加［8］；这些表明TLR4在心血管疾病中的作用越来越受到关注。    本研究显示，在Goldblatt大鼠左室重构心肌中TLR4 mRNA和蛋白表达均明显增高，分别是假手术组的1.72倍和1.60倍(P<0.01)；相关性分析表明TLR4蛋白表达与反映左室重构的LVMI及RWT明显相关。结合Ha等［9］在主动脉结扎所致心肌肥大的动物模型中发现，不仅TLR4基因缺陷鼠的心系数（心重/体重）、心肌细胞的大小较野生鼠明显降低，而且阻断TLR4信号通路可明显降低压力负荷所致的心肌肥大和心肌细胞凋亡，并改善心脏功能。推测TLR4及其介导的免疫炎症反应可能参与了高血压左室重构的发生和发展。    研究表明，除了病原体相关分子如LPS，组织损伤时释放的纤维连接蛋白(fibronectin)、细胞应激状态下产生的热休克蛋白（heatshock protein,HSP）等内源性配体也可激活TLR4［10］。Goldblatt大鼠模型建立在AngⅡ升高、循环及局部RAS系统的激活的基础上。AngⅡ本身不仅是一种促炎症介质，还可作为一种内在的氧化剂，促使氧化应激的发生。本实验中检测到在Goldblatt鼠左室重构心肌中AngⅡ含量明显增高，TLR4蛋白表达与心肌局部AngⅡ的含量相关联，同时与反应压力负荷的SBP、MESS呈显著正相关，提示压力负荷及AngⅡ可能参与调节TLR4的表达。TLR4作为跨膜信号转导蛋白，其表达量直接影响其介导的免疫炎症介质的效应，高血压左室重构中TLR4表达持续增加同时也增加了心肌对损伤刺激的易感性。对TLR4信号通路的干预可能是预防和逆转高血压左室重构的一个新的切入点。【参考文献】［1］Frantz S, kobzik L, Kim Y, et al. 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