脑缺血再灌注后实验大鼠核因子kappaB的变化
发表时间：2009-12-29 浏览次数：573次
脑缺血再灌注后实验大鼠核因子kappaB的变化作者：封菲，丁美萍 作者单位：1.杭州市第一人民医院，浙江杭州 ； 2.浙江大学医学院附属第二医院，浙江杭州 【摘要】 目的 研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后核因子kappaB（NF_κB）在时间上表达的变化过程。方法 线栓法建立右侧大脑中动脉闭塞大鼠模型，分别于缺血90min后再灌注2h，6h，12h，24h，72h，大鼠在各时间点断头取脑，测算脑梗死体积，用免疫印迹法检测脑组织胞核内NF_κB的表达。结果 脑缺血再灌注后NF_κB的表达在6h出现明显升高(P＜0.01)，在24h达到高峰，72h略有下降，其脑梗死体积随着再灌注时间延长而增加，脑梗死体积与NF_κB表达水平之间有显著的相关性。结论 脑缺血再灌注后，脑梗死区域出现胞核内NF_κB表达增加，NF_κB在再灌注损伤中起重要作用。 【关键词】 缺血再灌注；核因子kappaB；脑梗死体积；大鼠 The Changes of Nuclear Factor Kappa B (NF_κB) after Cerebral Ischemia Reperfusion in Rats. FENG Fei, DING Mei_ping. The First People's Hospital of Hangzhou. Zhejiang 310006, China ［Abstract］ Objective To investigate the activity of NF_κB after cerebral ischemia_reperfusion in rats. Methods Cerebral ischemia_reperfusion injury was induced by 90 min of middle cerebral artery (MCA) occlusion and followed by 2h, 6h, 12h, 24h, 72h reperfusion. The infarct volume was determined by TTC stain. Level of NF_κB P65 was determined by western blot. Results The time course of NF_κB induction in brain showed that NF_κB P65 subunit obviously increased at 6h, peaked at 24h and then decreased by 72h postreperfusion. There was an increase trend in brain infarct area by time. Conclusions The level of NF_κB was increased after ischemia_reperfusion and it attenuated brain injury. ［Key words］ Ischemia_reperfusion; NF_κB; Brain infarct volume; Rats 脑缺血再灌注是一个复杂的病理生理过程，再灌注时的炎症反应促进了继发性脑损害，是脑再灌注损伤的主要原因之一。核因子κB（Nuclear Factor kappaB，NF_κB）是一种广泛存在于细胞中具有多向性转录调节作用的蛋白质因子，对再灌注期间诱导表达的诸多炎症介质编码基因具有转录调控作用［1］。通常所说的NF_κB是指在NF_κB/Rel家族成员中具有主要生物活性的p50/p65异源二聚体。本实验采用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞模型，观察大鼠脑缺血再灌注时NF_κB在时间上表达的变化过程。1 材料及方法 1.1 材料：用Medbrain 2.0处理系统（浙江大学医学院神经生物学实验室提供）,电泳及转膜装置(美国BIO_RAD公司)。试剂：小鼠抗大鼠NF_κB/P65单克隆抗体（美国Santa Crutz公司提供，工作浓度1∶100），0.5%的氯化三苯四唑氮（TTC）溶液，大鼠核蛋白抽提试剂（NE_PERTM核蛋白抽提，Pierce公司）。 1.2 方法： 1.2.1 实验工作时间：2005年2月至2006年2月。 1.2.2 动物模型制备及处理：成年健康雄性Sprague_Dawley大鼠60只（体重250～300g，清洁度Ⅱ级，浙江省医学科学院动物中心提供）。将60只大鼠随机分为两组，A组为假手术组30只，B组为实验组共30只，每组按再灌注时间不同再分为2h，6h，12h，24h，72h共5个亚组，各亚组均为6只。用10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，实验组按照Bederson等［2］的方法制作大鼠脑缺血再灌注模型，手术前后大鼠肛温维持在（37±0.5）℃。缺血90min后抽提栓线至颈外动脉残端内进行再灌注。假手术组在分离颈动脉鞘后未插入栓线。 1.2.3 脑梗死体积测定：大鼠用200ml生理盐水经心脏灌流后快速断头取脑，去除嗅球和脑干，连续冠状切片，片厚2mm。取第4脑片放入液氮罐后转入-80℃冰箱保存用于蛋白提取，其余脑片放入0.5%的TTC溶液，37℃孵育箱中孵育30min后，多聚甲醛固定24h。摄片后采用Medbrain 2.0处理系统（浙江大学医学院神经生物学实验室提供），计算每一脑片正常侧及缺血侧脑半球红染（未缺血）的面积，两者相减得到矫正后的缺血面积。面积乘以厚度，并迭加每片数据后得到脑梗死灶体积百分比。 1.2.4 免疫印迹法检测大鼠脑组织中核内NF_κB P65蛋白的表达：提取大鼠脑组织核蛋白，根据说明书操作。用Bradford法进行蛋白定量测定。样品加等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液混合后, 以20ul蛋白量每泳道上样, 经10%SDS_PAGE电泳后, 电转膜至PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭后，膜片与一抗（小鼠抗大鼠NF_κB/P65单克隆抗体）4℃过夜，洗涤后与二抗－辣根过氧化物酶（HRP）交联物反应，再经适当洗涤后用强化学发光试剂（ECL）显色剂显色后胶片暴光，对条带进行扫描，用quantity one软件对条带光密度进行数据分析。 1.2.5 统计方法：结果用x－±s表示，采用SPSS11.0 for Windows统计软件包，以t检验作差异的显著性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 缺血再灌注脑组织梗死体积的影响：实验组大鼠脑梗死体积比例均随再灌注时间延长而增加，见表1。 表1 各组大鼠不同时间点的脑梗死体积比例 2.2 缺血再灌注后脑组织细胞核内NF_κB/P65蛋白表达的变化：假手术组仅见微量NF_κB亚基P65蛋白的表达，各时间点均无明显差异。实验组缺血再灌注24h内P65蛋白表达随再灌注时间延长而增多，再灌注72h其表达较24h表达减少。再灌注6h，12h，24h，72h时实验组NF_κB/P65蛋白表达较假手术组显著增多（P＜0.01）。各组大鼠脑组织细胞核内NF_κB/P65蛋白表达的光密度值见表2。表2 各组大鼠不同时间点核内NF_κB/P65蛋白表达注：与假手术组比较，*P＜0.01 2.3 脑梗死体积和NF_κB表达的相关性：脑梗死体积与NF_κB表达水平（r=0.75,n=30,P＜0.01）之间有显著的相关性。3 讨论 本文显示，核因子κB（NF_κB）在大鼠脑缺血再灌注后6h明显增高，24h达到高峰，72h时有所减少，这与有关报道一致［3］。核因子κB是一种具有多向性转录调节作用的蛋白质因子，具有和某些基因启动子区固定核苷酸序列（即κB位点）结合而启动基因转录的功能［4］。缺血再灌注过程中,在氧自由基、兴奋性氨基酸、细胞因子如白细胞介素_1β、TNF_α等刺激下,缺血区内的神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞内的与炎症有关的关键转录因子NF_κB激活,向核内转移,与其靶基因结合,促进与炎症有关的细胞因子表达,包括IL_1β、TNF_α、ICAM_1、VCAM_1、趋化因子IL_8和选择素等,NF_κB与IL_1β、TNF_ α形成正反馈,促进中性白细胞粘附及迁移,导致炎症反应［5］，及微血管的再闭塞。另外NF_κB还能诱导凋亡的潜在靶基因如p53、C_myc、Fas/Apo_1以及白介素转换酶等,激活NF_κB的刺激均能激活这些死亡基因，但也有研究表明NF_κB活化亦可介导细胞保护反应,诱导抗凋亡蛋白表达,包括Bcl_2、锰过氧化物岐化酶、钙结合蛋白等阻止凋亡,保护神经元,抵抗氧化和代谢损伤。 本实验发现缺血再灌注后大鼠缺血区胞核内表达量在再灌注后6h明显升高, 于再灌注24h达到高峰，之后有所下降，脑梗死体积的增加与NF_κB的表达有显著的相关性，提示了NF_κB在再灌注损伤中起重要作用。【参考文献】 ［1］Zwacka RM, Zhou W, Zhang Y, et al. Redox gene therapy for ischemia/reperfusion injury of the liver reduces AP1 and NF_kappaB activation［J］. Nat Med, 1998,4:698-701. ［2］Berderson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］. Stroke, 1986, 17:472-476. ［3］Stephensen D, Yin T, Smalstig ED, et al. Transcription Factor Nuclear Factor kappa B is activated in neuron after focal cerebral ischemia［J］. J Cereb blood flow Metab, 2000, 20:592-596. ［4］Hess DC, Howard E, Cheng C, et al. Hypertonic mannitol loading NF_κB transcription decoys in human brain microvascular endothelial cells blocks up regulation of ICAM_1［J］. Stroke, 2000, 31:1179-1186. ［5］Lee JI, Burckart GJ. Nuclear factor kappaB: important transcription factor and therapeutic tatget［J］. J Clin Pharmacol, 1998, 38:981-983.
