胞二磷胆碱、硫酸镁联用对大鼠局灶脑缺血后梗死体积、细胞凋亡及Caspase_3 mRNA表达的影响
发表时间：2009-12-29 浏览次数：570次
胞二磷胆碱、硫酸镁联用对大鼠局灶脑缺血后梗死体积、细胞凋亡及Caspase_3 mRNA表达的影响作者：严永兴，梁丽贞，张利军，吴春丽，刘慧丽 作者单位：1.杭州市第三人民医院神经内科，浙江 ； 2.上海市普陀区医院神经内科，上海 【摘要】 目的 研究胞二磷胆碱、硫酸镁联用对局灶脑缺血大鼠的神经保护作用。方法 用大脑中动脉栓塞法制作局灶脑缺血模型，观察胞二磷胆碱、硫酸镁单用及不同剂量联用7天后，大鼠神经功能缺损、脑梗死体积、凋亡细胞数及Caspase_3 mRNA表达。结果 与对照组相比，胞二磷胆碱、硫酸镁单用及两药联用组脑梗死体积较小，Caspase_3 mRNA表达、凋亡细胞数均较少，差异有显著性(P＜0.05)。两药联用组脑梗死体积、Caspase_3 mRNA表达、凋亡细胞数较两药单用组减少(P＜0.05)。不同剂量两药联用组相比各项指标均无显著差异(P＞0.05)。结论 胞二磷胆碱与硫酸镁联用对局灶脑缺血的神经保护有协同作用。 【关键词】 胞二磷胆碱；硫酸镁；局灶脑缺血；联用；神经保护 The Effects of Combined Citicoline and Magnesium Sulfate on Expression of Caspase_3 and Apoptotic Cells after Focal Cerebral Ischemia in Rats. YAN Yong_xing, LIANG Li_zheng, ZHANG Li_jun, et al. The Third People's Hsopital of Hangzhou, Zhejiang 31009, China ［Abstract］ Objective To investigate the neuroprotective efficacies of citicoline and magnesium sulfate combination in experimental focal cerebral ischemia in rats. Methods SD rats were subjected to focal cerebral ischemia with the model of middle cerebral artery occlusion. Expression of Caspase_3 mRNA and apoptotic cells in infarction were detected, neurologic deficit score were quanfitied and infarct volumes were assessed after citicoline, magnesium sulfate and combination administration for 7 days. Results Infarct volume of citicoline, magnesium sulfate and combination groups were significantly reduced, Caspase_3 mRNA positive cell and apoptotic cell numbers were significantly fewer compared with control groups, respectively(P＜0.05). Infarct volumes of two combination groups were significantly reduced, Caspase_3 mRNA_positive cell and apoptotic cell numbers were significantly fewer compared with citicoline, magnesium sulfate groups, respectively. There was no difference between combination groups (P＞0.05). Conclusions citicoline and magnesium sulfate combination may exert a synergistic neuroprotective effect during the focal cerebral ischemia. ［Key words］ Citicoline; Magnesium sulfate; Cerebral ischemia; Focal; Combination; Neuroprotection 脑缺血所激发的一系列级联反应和多重病理机制介导了缺血半暗带从潜在可逆性缺血逐渐向不可逆性损伤进展。缺血后的级联反应决定了神经元的命运，主要涉及氧自由基的产生、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙超载、能量代谢障碍及炎症介质释放等。由于缺血性脑损伤是一系列复杂、多因素过程，针对任何单一环节的神经保护治疗不可能完全、有效地阻断缺血性脑损伤的级联反应，因此目前单一神经保护剂在动物模型上有效，而在临床效果不佳。联合应用作用于脑缺血不同损伤机制的药物能否达到协同作用，有效地抑制级联反应，本研究观察胞二磷胆碱(cytidine 5'_diphosphate choline, CDP_c)、硫酸镁联用对脑梗死体积、凋亡细胞及Caspase_3 mRNA的影响，现将结果报道如下。1 资料与方法 1.1 主要试剂：红四氮唑(2,3,5_triphenyltetrazolium chloride, TTC,中国医药集团上海化学试剂公司)；CDP_c(山东齐鲁制药厂)；硫酸镁(杭州民生药业有限公司)；细胞凋亡检测试剂盒(Boster生物工程技术公司)；Caspase_3 mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。 1.2 动物分组、模型建立与用药：雄性SD大鼠130只，体重260±10g(浙江中医药大学实验动物中心提供)。采用Longa线栓法［1］阻塞大鼠大脑中动脉，建立急性局灶脑缺血模型，1.5小时后，将尼龙线轻柔退致颈外动脉处，即为再灌注开始，术中和术后保温，肛温37℃。术中将尼龙线仅留在颈内动脉而不入颅为假手术组，假手术组10只，其余120只大鼠随机分6组，(1)模型组(2)对照组(0.9%氯化钠1ml/kg/d)(3)CDP_c(250mg/kg/d)组(4)硫酸镁(90mg/kg/d)组(5)两药联用组(CDP_c 250mg/kg/d，硫酸镁90mg/kg/d)(6)两药联用小剂量组(CDP_c 150mg/kg/d，硫酸镁60mg/kg/d)，每组20只，其中一半用于测定脑梗死体积。各药均溶于1ml 0.9%氯化钠中，造模成功后各组静脉注射1次，不少于15分钟注射完，再灌注90min后给药1次，以后每天一次，连续7天。模型组不注射。 1.3 脑梗死体积测定：治疗7天后断头取脑，冷冻后等分切成2mm厚脑片，浸入37℃ TTC生理盐水溶液中染色30min。染色后将脑片浸入4%中性多聚甲醛固定保存，拍照后用Ulead photo Express 2.0图象分析软件进行脑梗死轮廓勾画，法医损伤测量软件测量脑缺血面积，算出每个大脑梗死体积百分比。 1.4 神经功能缺损评分：治疗7天后，处死前采用Bedersons［2］神经功能评分法。 1.5 Caspase_3 mRNA原位杂交及TUNEL法检测细胞凋亡：治疗7天后，麻醉大鼠固定取材。按试剂盒提供的步骤进行，DAB显色，细胞浆着棕色者为Caspase_3 mRNA阳性细胞；按试剂盒提供的步骤进行，苏木精轻度复染，细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。每只大鼠均取3张切片，在每张脑切片的缺血梗死部边缘随机选取5个高倍镜(400倍)不重叠视野，在图像分析仪下，计数阳性细胞数。 1.6 统计方法：所有数据均以x－±s表示。用SPSS 10.0统计软件进行统计处理，对所有结果进行正态性及方差齐性检验后，进行单因素方差分析，P＜0.05为有显著差异。2 结果 2.1 脑梗死体积与神经功能评分：各治疗组与对照组相比梗死体积、神经功能评分较小(P＜0.05)；两药联用组梗死体积、神经功能评分均比单用组小(P＜0.05)；两药联用组相比，无显著意义(P＞0.05)，神经功能评分与脑梗死体积的变化无相关性(P＞0.05)，见表1。 表1 脑缺血再灌注7天后各组神经功能评分和脑梗死体积 组 别神经功能评分脑梗死体积(%)1.模型组5.5±1.0833.86±3.92.对照组5.6±1.1735.75±4.53.CDP_c组4.0±1.1528.75±3.44.硫酸镁组3.6±0.9729.89±2.75.两药联用组2.9±0.74△21.93±3.97△6.两药联用小剂量组2.8±0.97△23.85±3.89△ 注：与1，2组比较，P＜0.05；与3，4组比较，△P＜0.05 2.2 Caspse_3 mRNA表达阳性细胞及细胞凋亡数：各治疗组Caspase_3 mRNA表达阳性细胞及凋亡细胞均较对照组少(P＜0.05)，两药联用组与单用组相比有显著差异。两药联用组相比，无明显差别(P＞0.05)，见表2。Caspase_3 mRNA表达阳性细胞、凋亡细胞数均与脑梗死体积的变化呈正相关(P＜0.05)，Caspase_3 mRNA表达阳性细胞与凋亡细胞数的变化无相关性(P＞0.05)。表2 脑缺血再灌注7天后各组Caspase_3 mRNA表达阳性细胞及细胞凋亡数(个/高倍视野)注：与1，2组比较，P＜0.05；与3，4组比较，△P＜0.053 讨论 脑缺血后神经元死亡是一个复杂的病理过程，脑缺血后级联反应是决定缺血后神经元命运的主要因素。抑制其中的一个或多个始动环节，将减轻级联反应程度而达到脑保护作用。既往研究认为CDP_c脑保护作用与抑制脑缺血诱导的谷氨酸浓度升高、阻止缺血所致ATP水平下降、稳定细胞膜、抑制自由脂肪酸的释放和减少自由基的产生有关［3～5］。镁离子的神经保护是通过其生理钙阻滞作用而起效的，镁离子还可能是通过抗兴奋毒性作用、血管舒张、降低半暗带谷氨酸和乳酸浓度保护细胞的能量代谢而起神经保护作用［4，6］。两药作用于级联反应的不同环节。 在缺血性脑损伤的保护治疗中，近年来主要是针对缺血后级联反应的单一环节干预治疗，其在动物模型中有效，而在临床中无效或效果不佳，联合应用作用于脑缺血损伤级联反应不同环节的神经保护剂是否能有效地阻断级联反应，达到比任何单一神经保护剂更好的脑保护作用，许多学者进行了研究。Lyden［7］等应用大鼠局灶性脑缺血模型，分别在缺血后30、60、75、120、240、360min给予GABA激动剂muscimol、NMDA受体拮抗剂MK801及二者联合应用，结果表明二者联合应用效果明显优于单独用药，因此认为联合用药将为脑缺血的治疗提供新途径。另外联合用药可减少单一药物的有效剂量，降低与药物剂量相关的毒副作用。Barth［8］等利用大鼠海马切片培养，造成缺氧、缺糖环境，联合应用bFGF与MK801，观察它们对神经元的保护作用，证实bFGF加强MK801的保护作用。Liniger［9］等研究也证实无论是低浓度还是高浓度的MK801与其他类型的神经保护剂联合应用，保护作用均增强，具有协同作用。而小剂量应用可有效减轻毒副作用，避免因副作用而限制药物应用。 动物实验表明，脑缺血治疗窗可分为再灌注窗和脑细胞保护窗，在细胞保护窗期间脑保护剂的应用可防止成熟损伤和已发生损伤的神经元的体积扩大，一般认为细胞保护窗约为1.5～3h，本文选择再灌注后1.5h给药，研究结果显示，大鼠局灶脑缺血再灌注7天后，单用CDP_c、硫酸镁与对照组比较均使大鼠局灶脑缺血后脑梗死体积明显缩小(P＜0.05)，神经功能缺损评分、Caspase_3 mRNA表达、神经细胞凋亡减少(P＜0.05)，但两组相比无统计学意义(P＞0.05)。这一结果与国内外研究相似［3，6］。两药联用组分别与单药组相比脑梗死体积减小，神经功能恢复较好，Caspase_3 mRNA表达，细胞凋亡数均较少，差异有显著性(P＜0.05)。而两药不同剂量联用组相比，各指标则无显著性差异(P＞0.05)。表明CDP_c与硫酸镁联用对神经的保护作用可能有协同作用，且联用可减少各单药的剂量。本研究提示多种不同类型脑保护剂联合治疗，可能通过不同途径相互增强神经保护作用，从而更好地阻止脑缺血损害的发展，且两药合用可减少每种单药的剂量。【参考文献】 ［1］Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. 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