蛋白酶体抑制剂MG132对外周血内皮祖细胞数量与功能的影响

蛋白酶体抑制剂MG132对外周血内皮祖细胞数量与功能的影响作者：杜常青,胡晓晟,姚雪艳    作者单位：浙江大学医学院附属第一医院，浙江?杭州 310003     【摘要】  目的 观察蛋白酶体抑制剂MG132对外周血内皮祖细胞(EPCs)数量与功能的影响。方法 采用Ficoll密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞,接种于包被人纤维连接蛋白的培养板,收集贴壁细胞,加入不同浓度MG132(20nmol/l,50nmol/l,100nmol/l,200nmol/l)培养12、24、48h。激光共聚焦显微镜鉴定,倒置荧光显微镜计数。分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定观察EPCs的增殖、迁移、黏附能力。结果 低剂量范围内，EPCs数量随MG132浓度与作用时间增加而减少,其增殖、迁移、黏附能力亦随MG132浓度与作用时间增加而减少。200nmol/l浓度MG132作用48h对EPC数量、增殖功能及黏附能力的影响最为显著。结论 低剂量MG132减少EPCs数量并抑制EPCs的增殖、黏附、迁移能力。     【关键词】  蛋白酶体抑制剂,内皮祖细胞,细胞数量和功能     Effects of Proteasome Inhibitor MG132 on number and Activity of Endothelial Progenitor cells from Peripheral Blood. DU Chang_qing, HU Xiao_sheng, YAO Xue_yan. Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Zhejiang 310003, China　　[Abstract] Objective To investigate the effects of low_dose proteasome inhibitor MG132 on the number and function of peripheral blood endothelial progenitor cells (EPCs). Methods Mononuclear cells (MNCs) were isolated from peripheral blood by Ficoll density gradient centrifugation, and then the MNCs were plated on fibronectin_coated culture dishes. After 7days culture , adherent cells were treated with low_dose proteasome inhibitor MG132 in a series of final concentrations of 20nmol/l,50nmol/l,100 nmol/l,200nmol/l for 12，24，48h. EPCs were identified as adherent cells double positive for DiLDL_up_take and lectin binding by direct fluorescent staining under a laser scanning confocal microscope. EPCs proliferation，adhesion and migration were assayed with MTT, adhesion assay and modified Boyden chamber assay, respectively. Results Incubation of isolated human MNCs with low_dose proteasome inhibitor MG132 decreased the number of EPCs, and MG132 also decreased EPCs proliferative, adhesive and migration capacity in a concentration_and time_dependent manner. Conclusions Low_dose proteasome inhibitor MG132 was found to decrease the numbert, proliferation, adhesive and migratory capacities of the EPCs.　　[Key words] Proteasome inhibitor; Endothelial progenitor cells; Cell number and function　　内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型的前体细胞,在血管损伤、内皮修复中起重要作用[1,2]。研究发现，心血管疾病的各种危险因素如高血脂、高血压、高同型半胱氨酸血症等能通过不同机制影响内皮祖细胞数量和功能，因此Hill等指出EPC水平可作为评价内皮功能和累积心血管危险因素的指标[3]。　　蛋白酶体抑制剂是一类通过对泛素化通路阻断、抑制蛋白酶体活性的新型药物[4]，具有促凋亡，抗增殖，抗炎等特性。研究表明，低剂量蛋白酶体抑制剂能诱导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达，刺激一氧化氮(NO)的产生，同时上调内皮抗氧化系统的酶和蛋白表达，从而发挥内皮保护作用[5]。目前,蛋白酶体抑制剂对内皮祖细胞的数量、增殖、迁移和粘附的影响尚不清楚。本研究观察低剂量蛋白酶体抑制剂MG132对内皮祖细胞数量和功能的影响,旨在探讨蛋白酶体抑制剂对血管内皮化的可能影响。1 材料与方法　　1.1 材料：蛋白酶体抑制剂MG132购自碧云天生物公司;M199及FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC_UEA_Ⅰ)均购自Sigma公司;Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL_Dil)购自Molecular Probe公司;胎牛血清购自Gibico;二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自华美生物工程公司;胰蛋白酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司;血管内皮生长因子购自Chemicon公司;淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技公司;改良的Boyden小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂。　　1.2 EPC的分离及培养：取健康志愿者成人外周血20ml，采用密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞,将其接种在有人纤维连接蛋白包被的培养板上。M199培养基(含10%胎牛血清,VEGF 50ng/ml,青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)培养4天,换培养液继续培养至7天,用M199洗去非贴壁细胞,贴壁细胞供实验用。　　1.3 实验分组：贴壁细胞随机分成五组,每组6孔,一组为对照组(正常培养组),其余四组分别加入含(20nmol/L,50nmol/L,100nmol/L,200nmol/L)MG132的培养基。每组分别培养12h、24h,48h。　　1.4 细胞染色与鉴定：细胞与acLDL_Dil(2.4ug/ml)37℃下孵育1h以检测EPCs对acLDL_Dil的摄取。用2%多聚甲醛固定细胞10min后，用PBS浸洗,将FITC_UEA_Ⅰ(10mg/ml)加入上述标本在37℃下孵育1h。激光共聚焦显微镜(LSCM,Leica)鉴定FITC_UEA_I和acLDL_Dil双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。倒置荧光显微镜下每孔计数取平均值(计数10个随机选择的×200视野EPCs)。　　1.5 EPCs黏附能力检测：用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁细胞,悬浮在500μl培养液中计数。后将同等数量的EPCs接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,在37℃下培养30min,计数贴壁细胞。　　1.6 EPCs增殖能力检测：用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁细胞,悬浮在500μl培养液中计数。再将等量EPCs接种在人纤维连接蛋白包被的96孔培养板上,隔夜培养后每孔加20μl MTT,培养4h,吸弃上清液,加入二甲基亚砜(150μl/孔),于微量振荡器充分振荡10min,置酶标仪于波长490nm处测OD值。　　1.7 EPCs迁移能力检测：如上述方法搜集贴壁细胞并计数。将VEGF和25μL培养液加入改良的Boyden小室的下室,将2×104EPCs悬浮在50μL培养液注入上室,培养24h,刮去滤膜上面的未移动细胞,用甲醇固定,Giemsa染色,随机选择3个显微镜视野(×200)，计数迁移到低层的细胞。　　1.8 统计学处理：数据以x-±s表示。采用SPSS 15.0统计软件分析，对计量资料组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。2 结果　　2.1 EPC的鉴定：密度梯度离心法分离获得的外周血单个核细胞(图1在封三)，培养7天后形成了梭形的内皮样细胞(图2在封三)。用acLDL_Dil和FITC_UEA_Ⅰ对细胞染色后,通过激光共聚焦显微镜鉴定,FITC_UEA_Ⅰ和Dil_acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC,在倒置荧光显微镜下(×400)计数10个随机选择视野的EPCs。　　2.2 MG132对外周血EPC影响，呈浓度和时间依赖性。见表1，2。MG132显著减少EPC数量，同时明显降低了EPC的增殖能力、粘附增殖能力、迁移能力。表1 不同浓度MG132作用48h对外周血内皮祖细胞数量及功能的影响注：与对照组比较P<0.05，△P<0.01表2 200nmol/l MG132对外周血内皮祖细胞数量、增殖、粘附、迁移能力影响的时效关系注：与对照组比较P<0.05;△P<0.013 讨论　　泛素_蛋白酶体通路(ubiquitin_proteasome system,UPS)是ATP依赖性的、非溶酶体的蛋白质降解通路,能选择性地降解细胞质和胞核内变性、变构的蛋白质，从而维持细胞及整个生物体的正常功能[16]。UPS除了介导蛋白降解外,还在细胞凋亡、抗原提呈和炎症[7]等方面发挥重要作用。近年来的研究发现,该通路还参与了心力衰竭[8]、缺血再灌注损伤[9]、PCI术后血管再狭窄[6]等心血管疾病的发生发展。　　三肽基乙醛(MG132)是一种可逆的醛基肽类特异性蛋白酶体抑制剂，通过阻止26S蛋白酶体对泛素化靶蛋白的降解、抑制类糜蛋白酶活性,从而阻断UPS。Meiners等[16]在大鼠颈动脉球囊损伤模型的实验中发现,局部应用高剂量MG132对颈动脉内膜细胞和平滑肌细胞均有显著的抗增生、抗炎作用，并抑制损伤后血管内皮的增生，从而有效改善再狭窄，作者提出应用蛋白酶体抑制剂洗脱支架将是防治再狭窄的新途径。Veschini等报道[10]，另一种蛋白酶体抑制剂硼替唑咪对脐静脉内皮细胞有双重效应：低剂量促进细胞增殖，诱导血管形成，而高剂量却导致细胞生长停止，血管生成抑制。　　近年研究表明,作为血管内皮细胞的前体细胞，骨髓和外周血来源的内皮祖细胞(EPC)的动员与分化可促进血管新生,并在成体血管新生中起重要作用[2]。本文采用体外培养人外周血EPC，观察了不同浓度的MG132对其数量和功能的影响。结果表明，即使在低剂量范围内，MG132即显著影响EPC的各项生物学功能，使EPC的粘附、迁移、增殖能力明显被抑制，这些改变呈浓度和时间依赖性，200nmol/l浓度组达最大抑制。该结果提示蛋白酶体抑制剂可能因抑制作为内皮细胞前体的EPC的各项功能，从而影响内皮修复和早期内皮化。相关研究也显示，蛋白酶体抑制剂具有抑制血管形成的效应，能抑制内皮细胞迁移活性和抑制其分泌生长因子[10，11]。蛋白酶体抑制剂诱导或抑制内皮凋亡取决于所用药物浓度，细胞类型以及细胞是否处于分化状态[12]。　　低剂量蛋白酶体抑制剂MG132导致EPCs数量减少和功能受损的确切机制尚不明确,可能与下列因素有关:1.增加EPCs的凋亡。研究发现，EPCs对诱导凋亡高度敏感;一些增殖相关蛋白如细胞周期素、周期素依赖激酶抑制剂及p53,c_myc和bcl_2等凋亡相关蛋白都是蛋白酶体的底物。研究表明,蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体功能，更易诱导处于快速增殖状态细胞或肿瘤细胞的凋亡[12，13]。2.MG132可能通过其它信号转导途径影响EPCs的分化和动员。多项研究表明，泛素_蛋白酶体通路在CD34+造血干细胞的增殖、分化、归巢等过程中起重要作用。蛋白酶体抑制剂通过抑制核因子_kappa B的活性，诱导CD34+造血干细胞凋亡，抑制其分化、增殖及克隆集落形成[12，14]。　　蛋白酶体抑制剂作为一类新抗肿瘤药物，由于同时具有抗增殖、促凋亡和抗炎等特性，近年来不少研究探索其防治再狭窄的可行性[15，16]。本研究结果提示应用蛋白酶体抑制剂防治血管成形术后再狭窄时,可能也将阻抑外周血EPC参与损伤内皮的修复，从而导致损伤内膜再内皮化延迟，引起迟发性支架内血栓形成和心血管死亡等不良事件。摸索一个平衡的剂量/局部浓度，可能是解决这一问题的技术关键。本实验仅观察不同浓度MG132对体外培养的人外周血来源内皮祖细胞数量和功能的影响，仍需在体实验进一步研究证实。【参考文献】　　[1]Schmidt_Lucke C, Rossig L, Fichtlscherer S, et al. 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