同型半胱氨酸对内皮细胞凋亡及JNK表达的影响

同型半胱氨酸对内皮细胞凋亡及JNK表达的影响作者：何志勇,叶小军,邵胜敏    作者单位：1.温州医学院附属第二医院神经内科，浙江?温州 325003;2.杭州市第二人民医院，浙江?杭州 310015     【摘要】  目的 了解同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)对内皮细胞凋亡及JNK表达的影响。方法 用不同浓度的Hcy处理内皮细胞后，TUNEL方法检测细胞凋亡，Western Blot检测细胞磷酸化JNK的表达。结果 随着Hcy浓度的升高，细胞凋亡数目明显增加，各组细胞磷酸化JNK的表达也逐步增强，且具有显著性正相关。结论 Hcy能引起内皮细胞凋亡及磷酸化JNK表达的增强。    【关键词】  同型半胱氨酸,内皮细胞,JNK,脐静脉    The Effects of Homocysteine on JNK Express and Apoptosis of Human Umbilical Veins Endothelial Cell. HE Zhi_yong, Ye Xiao_Jun, SHAO Sheng_min. Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Zhejiang 325003, China　　[Abstract] Objective To investigate the effects of homocysteine (Hcy) on endothelial cell apoptosis and the expression of JNK. Methods After treated with different concentrations of Hcy, the apoptosis was detected by TUNEL and JNK expression was examined with Western Blot assay. Results Hcy promotes both endothelial cells apoptosis and the expression of phospho_JNK in a dose_dependent manner. Conclusions Hcy can induce endothelial cell apoptosis and promote phospho_JNK expression.　　[Key words] Homocysteine; Endothelial Cells; JNK expression; Apoptosis　　研究表明，同型半胱氨酸是动脉粥样硬化的独立危险因素，可能通过内皮细胞损伤、刺激平滑肌细胞增生及引发血栓等多方面作用促进动脉粥样硬化，其中内皮细胞结构和功能上的损伤能启动动脉粥样硬化发生，以及发展。因此Hcy在损伤内皮细胞，促进内皮细胞凋亡中所发挥的作用尤受关注。目前对于Hcy引起内皮细胞凋亡的具体机制仍在探索中。研究已经表明丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen_activated protein kinase, MAPK)家族可转导并调控细胞凋亡信号，而JNK信号通路则在其中起着十分重要的作用。为了解Hcy能否激活内皮细胞JNK信号通路，本实验采用体外细胞培养，用不同浓度Hcy处理内皮细胞，观察细胞凋亡及磷酸化JNK的表达，探讨Hcy对内皮细胞凋亡的可能机制。1 材料与方法　　1.1 实验材料：人脐静脉内皮细胞细胞株(Human Umbilical Veins Endothelial Cell Line,HUVEC)购于上海坤肯特生物技术有限公司，Homocysteine购于Sigma，RPMI1640购于GBICO，Tunel法凋亡检测试剂盒购于美国Roche公司，细胞裂解液、预染的分子量Marker、兔抗人P_JNK1/2(磷酸化JNK)、JNK1/2多克隆抗体、羊抗兔二抗购于Cell Singnal，胎牛血清购于杭州四季青生物公司。电泳系统为美国BIO_RAD公司。　　1.2 细胞培养及实验分组：　　1.2.1 细胞培养：细胞在37℃，5%CO2，饱和湿度的恒温孵箱中培养，培养基为含10%胎牛血清的RPMI_1640培养基，细胞为上皮样贴壁生长，两天换液一次，每3～4天经胰蛋白酶消化后传代一次，取对数生长期的细胞用于实验。　　1.2.2 实验分组：将HUVEC按1×105/ml的密度接种于含有盖玻片的6孔板内进行爬片培养，用含10%FBS的RPMI1640培养液培养，待细胞长至盖玻片50%的时候，改换成用无血清的培养基继续培养24小时，细胞饥饿24h，使细胞同步化于G0期。根据Hcy浓度设5组，分别为对照组及4种Hcy浓度处理组(0.1、0.3、1.0、3.0mmol/L)，药物用完全RPMI_1640培养液溶解稀释，实验组用Hcy干预1.5h，对照组继续以无血清培养基培养1.5h。　　1.3 TUNEL方法检测细胞凋亡：取生长于盖玻片上的细胞按试剂盒说明书进行操作，在光镜下分析结果;细胞核内见到暗褐色颗粒为凋亡阳性细胞，在光学显微镜下每组细胞随机取3～5个不同视野，计算细胞凋亡指数(apoptosis index)=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。　　1.4 Western Blot检测不同浓度Hcy刺激下P_JNK1/2的变化:收集6孔板中内皮细胞，以D_hanks液洗后拍干，加入细胞裂解液，将蛋白裂解物超声及高速离心后吸取上清10μl测定各组标本的蛋白浓度。在垂直电泳两玻璃板间隙中灌注分离胶及浓缩胶,将已备好的蛋白样本煮沸5min，冰上骤冷，样品于聚丙烯酞胺凝胶电泳，上样时每样品上样两块平行胶，分别用于检测P_JNK1/2蛋白及JNK1/2蛋白，并加上预染的分子量Marker。停止电泳后取出凝胶，胶及硝酸纤维素膜在转移缓冲液中平衡15～20分钟，制备胶及转膜三明治，将转膜夹放入装有转膜缓冲液的电泳槽中，蛋白电转移至硝酸纤维素(NC)膜上。转膜完毕后，将膜置于TBS液平衡5分钟，5%脱脂牛奶室温封闭1小时，TBS/T洗膜5分钟×3次，孵育塑料小盒中加入5%牛血清白蛋白稀释的兔抗人P_JNK多克隆抗体(1:1000)或兔抗人JNK多克隆抗体(1:1000)，40℃过夜，TBS/T洗膜5分钟×3次;5%牛血清白蛋白稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1:1000)，室温2小时，TBS/T洗膜5分钟×3次。膜于增强发光检测试剂(试剂A:试剂B=1:1)反应5分钟，取出膜，甩去多余的检测试剂，保鲜膜包好NC膜，曝光，显影，定影。　　LISCAP CAPTURE凝胶照相分析软件分析P_JNK1/2及JNK1/2光密度值，两者均以对照组样品的光密度值为参照(定为1)，以此来标准化其他条带的光密度值，再以JNK1/2光密度值来标准化P_JNK1/2光密度值，即以P_JNK1/2光密度值/JNK1/2光密度值的比值代表样品P_JNK1/2的光密度。　　1.5 统计学分析：所得数据以均数±标准差(x-±s)表示，用SPSS(10.0)统计软件计算均数及标准差，进行方差齐性分析。各组间比较采用单因素方差分析(one_way ANOVA)，两两比较采用LSD法分析，P<0.05为差异有统计学意义。相关性采用直线相关分析。2 结果　　2.1 Hcy诱导内皮细胞凋亡：随着Hcy浓度增加，细胞凋亡数目明显增加，细胞凋亡指数升高，0.3mmol/L Hcy即可以引起凋亡指数明显升高，与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。3.0mmol/L Hcy时凋亡指数最高。　　2.2 Hcy对P_JNK1/2表达的影响：研究结果显示，各浓度实验组(分别0.1、0.3、1.0、3.0mmol/L Hcy)刺激P_JNK1/2均高于对照组，差异有显著性(P<0.01)，并且JNK1/2磷酸化程度与Hcy呈明显的剂量依赖关系，浓度越高，P_JNK1/2水平越高，最高的发生在3.0mmol/L，约3倍于对照组水平(P<0.01)，见图1及表1。图1 不同浓度Hcy刺激下P_JNK水平的变化表1 不同浓度Hcy对内皮细胞P_JNK表达的影响注：与对照组相比P>0.05，P<0.01　　2.3 P_JNK1/2表达与细胞凋亡的相关性：为分析P_JNK1/2与细胞凋亡的关系，实验对P_JNK1/2光密度值与TUNEL检测的细胞凋亡指数进行了相关性分析，结果Pearson相关系数为0.845(P<0.01)，提示P_JNK1/2光密度值与细胞凋亡指数存在正相关。3 讨论　　目前国内外实验[1,2]已经证实Hcy能导致体外培养内皮细胞凋亡，本实验结果也证实了这点，关于JNK在Hcy引起内皮细胞凋亡过程中的作用仍不明确。Dong F等[2]用Hcy诱导人脐静脉内皮细胞凋亡时，通过免疫印迹法证实在内皮细胞凋亡的时候，可以上调还原型辅酶Ⅱ氧化酶和SAPK/JNK信号途径，他们认为Hcy诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡是通过还原型辅酶Ⅱ氧化酶或者JNK依赖的机制进行的。也有学者[3]证实Hcy在HUVEC引起JNK的激活作用，并且转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)/肝再生因子1(LRF1)从而诱导凋亡，在HUVEC中的JNK的激活作用是通过ER固有的跨膜激酶IREα和IREβ调节的，但是TNF受体相关因子2(TRAF2)、MKK4和MKK7，还有反义的ATF3cDNA的显性负性突变体可以通过Hcy抑制细胞死亡，这些都表明JNK的激活作用在Hcy诱导的HUVEC凋亡中起着作用。　　JNK是MAPK信号转导通路中的一条重要信号传导途径，该信号通路的激活与凋亡密切相关。在脊椎动物JNK由JNK1、JNK2和JNK3组成，通过JNK1/2氨基酸残基的磷酸化激活JNK信号通路。目前认为JNK磷酸化后通过多种途径促进细胞凋亡。活化的JNK可以和转录因子ATF_2及c_Jun的氨基末端区域结合,使转录因子的活性区域发生磷酸化，转录因子ATF2、c_Jun和许多基因启动子上的AP_1(activator protein_1)和AP_1样位点结合,提高AP_1的转录活性,促进基因的表达和蛋白质的合成，新生蛋白质可能作用于细胞凋亡途径的某一环节而促进细胞凋亡[4～6]。JNK可以通过激活BH3家族的促凋亡的Bcl_2成员和强化Bax诱导的细胞死亡促进细胞凋亡[7]。　　本实验结果显示Hcy能明显促进体外培养的内皮细胞磷酸化JNK1/2的表达，而且随着浓度的升高，磷酸化JNK1/2的表达也明显增强，表明Hcy能激活JNK信号途径。而且实验中观察到内皮细胞凋亡与磷酸化JNK1/2的表达具有显著性正相关，提示JNK信号途径可能参与了Hcy诱导内皮细胞凋亡的过程，但Hcy激活JNK后通过何种途径最终引起内皮细胞凋亡还需进一步观察研究。【参考文献】　　[1]何志勇,王小同.两种定量方法检测同型半胱氨酸诱导内皮细胞凋亡的比较[J].实用医学杂志,2005,21(23):2643-2644.　　[2]Dong F,Zhang X,Li SY, et al. 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