辛伐他汀对人T淋巴细胞活性的影响

作者：胡欣，马晶，徐 岩    作者单位：1.解放军第105医院心内一科，安徽 合肥 230031;2.上海南汇区中心医院心内科;3.安徽医科大学第一附属医院心内科

【摘要】  目的：研究辛伐他汀离体情况下对人T淋巴细胞活性的影响。方法：体外培养人T淋巴细胞，用植物血凝素(PHA)作为刺激剂，加或不加辛伐他汀，分组培养。孵育24 h、48 h和72 h后收集细胞及培养上清液，以流式细胞术测定T淋巴细胞抗原，以实时逆转录聚合酶链反应(Realtime RT-PCR)检测T淋巴细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6基因表达水平，放免法测定上清液TNF-α、IL-6浓度，免疫组化方法检测T淋巴细胞内核因子(NF-κB)的表达水平。结果：①辛伐他汀可以明显抑制人T淋巴细胞表面抗原CD25、CD69的表达(P<0.05);②辛伐他汀对人T淋巴细胞表达分泌TNF-α、IL-6有明显抑制作用(P<0.05);③辛伐他汀可以明显抑制T淋巴细胞内NF-κB的转位入核(P<0.05)。结论：辛伐他汀可以抑制人T淋巴细胞活性，可能是其抗动脉硬化，治疗心衰的机制之一。

【关键词】  辛伐他汀;T淋巴细胞;细胞因子类;NF-κB

Effect of simvastatin on the activity of human peripheral blood T lymphocytes/HU Xin，Ma Jing，XU Yan//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine，2009，18(4):373

　　Abstract：Objective:To study the inhibitory effect of simvastatin on the activity of T lymphocytes.Methods:Jurkat cells were incubated with PHA with of without simvastatin in vitro，simvastatin was added on 2 h before PHA.The cells were collected after incubation 24，48，72 h.Then the expression of cell markers such as CD25、CD69 on cell surface was assayed with flow cytometry，and the levels of TNF-α and IL-6 mRNA were quantified with real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction.The TNF-α and IL-6 concentrations in the supernatants of Jurkat cells were measured by radioimmunoassay，and the transportion of NF-κB into the nuclear was detected by immunocytochemistry.Results:①Simvastatin significantly inhibited the expression of CD25 and CD69 on T lymphocyte surfaces(P<0.05);②The expression and production of TNF-α and IL-6 were inhibited by simvastatin(P<0.05);③Simvastatin significantly inhibited the transportion of NF-κB into the nuclear(P<0.05).Conclusion:Simvastatin had inhibitory effect on the activity of human peripheral blood T lymphocytes,it may be the mechanism of antiarteriosclerosis and heart dysfunction.

　　Key words：Simvastatin;T-lymphocytes;Cytokines;NF-kappa B

　　辛伐他汀是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，既往被广泛用于降低胆固醇治疗。以往认为他汀类药物通过其调脂作用防治冠心病(CHD)，近年发现在稳定粥样斑块时，其非调脂作用尤其是抗炎作用可能是其主要机制[1～4]。本研究拟对人的T淋巴细胞进行辛伐他汀离体干预，再予刺激剂刺激(设立对照组)，观察辛伐他汀对T淋巴细胞过度活化的影响及其干预T淋巴细胞活化的可能机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　所选T淋巴细胞(Jurkat)来自中国科学院上海细胞生物所，来源于急性T细胞白血病患者。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 实验分组：人T淋巴细胞体外培养后分为空白组、刺激剂组和辛伐他汀干预组。空白组作为基础值，加生理盐水体外培养;刺激剂组用植物血凝素(PHA)5 μg/ml体外活化T淋巴细胞;辛伐他汀干预组先加入辛伐他汀5μM 2h，然后加入PHA 5μg/ml体外培养。于24 h、48 h和72 h后分别收集T淋巴细胞和培养上清液，测定T淋巴细胞抗原、T淋巴细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6基因表达水平、上清液TNF-α、IL-6浓度、T淋巴细胞内核因子(NF)-κB的表达水平。

　　1.2.2 流式细胞仪检测T细胞CD25、CD69：收集培养细胞，取50 μl细胞悬液，分别加入5 μl CD25单抗-PE或CD69单抗-FITC混匀，25℃避光15 min，再加500 μl磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀后上机分析。

　　1.2.3 以实时逆转录聚合酶反应(Real-time RT-PCR)检测T细胞中TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平：用Trizol法提取细胞总RNA，逆转录生成cDNA;以β-actin为内参照，在ABI PRISM7700型荧光PCR仪(美国PE公司)上进行扩增。

　　1.2.4 放射免疫分析法检测培养上清中TNF-α、IL-6的浓度：采用放射免疫液相竞争法(RIA)。培养24 h、48 h和72 h后收集细胞，1000 r/min离心7min后，收集上清液-40℃冻存，集中检测。TNF-α及IL-6试剂盒均购自解放军总医院科技开发中心放免所。具体检测过程严格按试剂说明书进行。

　　1.2.5 免疫组化方法检测T细胞NF-κB的表达：采用免疫细胞化学S-P法。将T淋巴细胞涂片并固定，一抗为鼠抗NF-κ Bp65单克隆抗体，二抗为生物素标记羊抗小鼠IgG，以辣根酶标记链霉卵白素孵育，DAB显色。对照实验用PBS代替一抗。结果判断标准：细胞核中出现清晰的棕黄色颗粒判定为阳性。每张涂片随机计数3个视野，计算胞核阳性细胞数占细胞总数的百分比作为该份标本的阳性率。

　　1.3 统计学处理

　　数据用SPSS13.0软件分析，组间比较采用方差分析，数据以均数±标准差(±s)表示，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 辛伐他汀对T淋巴细胞表面抗原CD25、CD69表达的影响

　　PHA(5 μg/ml)能明显刺激T淋巴细胞的活化，表现在T淋巴细胞活化的表面标志物CD25和CD69分子的表达均明显上升。而在辛伐他汀作用后，T淋巴细胞表面活性化抗原CD25、CD69水平均明显下降(P均<0.05)。见表1、2。　表1 T淋巴细胞表面抗原CD25表达　表2 T淋巴细胞表面抗原CD69表达

　　2.2 辛伐他汀对T淋巴细胞TNF-α、IL-6表达的影响

　　辛伐他汀作用后，T淋巴细胞产生TNF-α、IL-6明显减少(P<0.05)。见表3、4。

　　2.3 辛伐他汀对上清液中TNF-α、IL-6浓度的影响

　　辛伐他汀作用后，上清液中TNF-α、IL-6浓度明显降低(P<0.05)。见表5、6。表3 T淋巴细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达　表4 T淋巴细胞白介素(IL)-6表达水平表5 上清液中TNF-α表达水平表6 上清液中IL-6表达水平

　　组 别24 h48 h72 h空白组44.626±1.16151.629±1.52652.816±1.523刺激剂组75.707±1.09687.195±2.96058.464±0.319辛伐他汀组48.929±2.52559.913±0.83748.120±0.010

　　2.4 辛伐他汀对T淋巴细胞NF-κB的影响

　　辛伐他汀作用后，T淋巴细胞明显抑制核因子NF-κB转位入核(P<0.05)。见表7。　表7 T淋巴细胞胞核因子(NF)-κB阳性率

　　3 讨 论

　　目前有临床研究发现他汀类药物可能改善慢性心力衰竭(CHF)患者的预后，但机制尚不清楚。激活的T淋巴细胞可以分泌大量的炎症细胞因子，同时表达某些特定的表面标志，如CD25、CD69、CD71等。检测这些表面标志可以了解T细胞活化情况，判断机体的免疫功能状态。本研究发现T淋巴细胞在PHA刺激下CD25、CD69表达增加，而在辛伐他汀作用后，CD25、CD69的表达减少，表明辛伐他汀对T细胞的活化有抑制作用。

　　核因子(NF-κB)是一个存在于各种组织中的因子，在正常情况下与其抑制因子(IκB)结合，以非活性状态存在于胞浆中。在炎症、缺血等刺激下，NF-κB激活后与IκB解体，进入细胞核，作用于靶基因，诱导TNF-α等炎症细胞因子的基因表达[5，6]。本研究发现T淋巴细胞在PHA刺激下TNF-α、IL-6 mRNA表达和分泌均增加，而在辛伐他汀作用后，二者均明显减少;同时发现在辛伐他汀作用后，T淋巴细胞内NF-κB转位入细胞核明显受到抑制。此结果表明辛伐他汀可以抑制T淋巴细胞表达分泌炎性细胞因子TNF-α、IL-6，且其机制可能是通过抑制T淋巴细胞内NF-κB的转位入细胞核实现的。

　　综上所述，辛伐他汀可能具有一定的抗炎作用。目前认为炎症是动脉粥样硬化、心力衰竭的重要机制之一，这也可能是他汀类药物的非降脂抗动脉硬化，治疗心衰的重要作用机制。当然对于他汀类药物的种类与剂量的选择是否对T淋巴细胞活性存在不同影响，目前尚不清楚，有待进一步研究。

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