益气活血复方对兔颈动脉内皮损伤后血管内膜增殖的影响

作者：刘会武，张 艳，孙江波    作者单位：1.辽宁中医药大学研究生学院，辽宁 沈阳 110032;2.辽宁中医药大学附属医院

【摘要】  目的：观察益气活血复方对兔颈动脉内皮损伤后血小板源性生长因子(PDGF)mRNA表达的影响。方法：28只兔被随机分3组:正常组，模型组，益气活血复方组。高脂喂养6周后以球囊拉伤方法建立兔颈总动脉内皮损伤模型。8周时处死动物，以逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测动脉损伤处PDGF-B mRNA表达，HE染色观察颈动脉组织病理形态学改变。结果：与模型组对比，益气活血复方明显抑制了动脉损伤后的内膜增殖反应，下调了内膜损伤处PDGF-B mRNA的表达水平(P<0.05)。结论：益气活血复方可以显著减轻兔血管成形术后内膜增生，其机制可能与抑制PDGF表达有关。

【关键词】  益气活血;血管成形术，经腔，经皮冠状动脉;血小板源性生长因子

Effect of reinforcing qi activat blood formula on the expression of PDGF in the rabbits after PTCA with hyperlipidemia/LIU Huiwu，ZHANG Yan，SUN Jiangbo//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine，2009，18(4):393

　　Abstract：Objective:To observe the effects of reinforcing qi activat blood formula(RQABF) on the expression of plateletderived growth factor (PDGF) in the rabbits after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) with hyperlipidemia.Methods:A total of 28 male New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups:The control group，model group and RQABF intervention group.The model of restenosis were established by injuring carotid arteries with PTCA in cholesterol fed rabbits.After 8 weeks，PDGF-B measured with reverse transcription polymerise chain reaction(RT-PCR) and pathologic alter were observed with HE staining.Results:By RT-PCR，the expression of PDGF-B mRNA in injured artery were much higher in model group(P<0.05),compared with the normal control group，the expression of PDGF-B and intimal hyperplasia markedly decreased in RQABF group,compared with those of model group(P<0.05).Conclusion:Reinforcing qi activat blood formula can inhibit the expression of PDGF-B and lighten the intimal hyperplasia after PTCA.

　　Author′s　address：Department of Internal Medicine,Hospital Affiliated to Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang，Liaoning，110032，China

　　Key words：Reinforcing qi activat blood;Angioplasty,transluminal,percutaneous coronary;Plateletderived growth factor

　　益气活血复方是张艳教授临床治疗冠心病经验方，用于防治经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)后再狭窄(restenosis，RS)取得较好疗效。为探讨其作用机理，本研究建立兔高脂环境下的颈动脉内皮球囊损伤模型，观察益气活血复方对球囊损伤后血管内膜增殖和血小板源性生长因子(PDGF)-B mRNA表达的影响，探讨其抗RS的可能机理。

　　1 资料与方法

　　1.1 动物分组

　　雄性新西兰大白兔28只，3月龄，体重(1.9±0.3)kg。随机分为正常组、模型组、益气活血复方组。实验药物：益气活血复方:由黄芪、丹参、党参、红花、益母草、三七、川芎组成。辽宁省中医研究院提供，提取有效成分，按规范工艺制成粉剂。分组: 正常对照组，8只，喂饲基础饲料; 模型组，10只，喂饲高脂饲料(基础饲料+1%胆固醇+6%花生油)100 g/d; 益气活血复方组，10只，按1 g生药/kg·d给药+高脂饲料100 g/d。用药组每天先给予按体重计算所需药量的含药饲料，由专人观察并证实动物服用后再投用高脂饲料，高脂饲料不足者补以正常饲料，每只兔分笼饲养，自由饮水，均喂饲8周。

　　1.2 颈总动脉球囊损伤模型的建立及给药

　　6周后模型组和益气活血复方组家兔以20%乌拉坦5ml/kg腹腔麻醉，颈部剪毛，75%酒精消毒，沿颈前正中线剪开皮肤3～4 cm，依次分离皮下组织、肌肉并暴露气管，游离右侧颈总动脉(CCA)，颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)。将ECA远心端结扎，CCA近心端用动脉夹临时夹闭后，用眼科剪在ECA结扎处近心端做“V”型切口，大小约为管壁周径的1/3，以血管拉钩拉起动脉切口，直视下逆行插入球囊导管(2.5 mm×14 mm，美国Boston Scientific公司)约4 cm，至CCA，连接手推式压力泵以8atm向球囊内注入肝素生理盐水将其充分膨胀，维持压力，慢速回拉球囊至颈内外动脉分叉处，回抽生理盐水后重新送回导管，重复3次以充分剥脱内皮细胞，最后撤出导管，再结扎ECA近心端，松开动脉夹，恢复血流，逐层缝合皮下脂肪及皮肤切口。所有操作均在无菌条件下进行。术后肌肉注射青霉素10万U/kg预防感染，连续3 d。本实验共成功建立家兔血管成形术模型17只，其中模型组8只，益气活血复方组9只。

　　1.3 标本采集与处理

　　第8周末，各组动物称重、采血完毕后行血管取材。以20%乌拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉，沿旧切口剪开皮肤，分离皮下组织，暴露双侧颈总动脉。分离出右侧手术损伤血管段，结扎两端后剪取长约3cm血管段投入冰磷酸盐缓冲液(PBS)中，洗净残血并去除血管周围过多的脂肪及结缔组织。一分为2段，一段置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片(厚度4μm) HE染色;一段置于二乙基焦磷酰胺(DEPC)处理弹头管中，-80℃保存，用于逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测。

　　1.4 半定量检测颈动脉组织的PDGF-B mRNA表达

　　RT-PCR法：用Trizol(invitrogen 公司，批号：1203405)试剂常规抽取组织总RNA。RNA产物经紫外分光光度计检测A260nm～A280nm吸光度，计算纯度和含量，A260/A280吸光度均在1.8～2.0之间。使用一步法RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司，批号：Bk2201)进行逆转录扩增。RT反应条件: 65℃ 1 min，30℃ 5 min，65℃ 20 min，98℃ 5 min，5℃ 5 min。PDGF-B引物序列: 上游5′-CAGGCGAGCGGCCGCG-3′，下游5′-CTTGCCCACCGAGTCGAAT-3′，扩增片段长度145bp;内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物序列:上游5′-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3′，下游5′-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3′，扩增片段长度528 bp。引物均由大连宝生物工程有限公司合成。PCR反应条件:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，终末延伸72℃ 5 min(PE 9600 PCR仪35号程序)。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果，Quantity One软件进行灰度扫描，以GAPDH为内参基准作半定量分析(即目的基因相对表达量=目的基因条带总光密度/内参GAPDH条带光密度)，测定样本PDGF-B mRNA的相对表达量。

　　1.5 统计分析处理

　　用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较用t检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 病理学观察结果

　　光镜下正常组血管壁三层结构清晰;模型组内膜增生严重，管腔明显狭窄，内弹力板不连续，可见大量平滑肌细胞由中膜向内膜迁移并增生，细胞排列紊乱，有大量泡沫细胞及纤维结缔组织形成;治疗组血管病变程度明显轻于模型组，管腔显著增大(图1，见封二)。

　　2.2 各组兔颈动脉PDGF-B mRNA表达水平比较

　　经1%的琼脂糖电泳可见清晰的28 s、18 s、rRNA，证实 RNA的完整性。经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色紫外灯下观察可见清晰的DNA条带，据DNA Mark显示为145 bp的PDGF-B的条带，528bp的GAPDH内参条带(图2)。由表可见，模型组动脉组织表达的PDGF-B mRNA明显高于正常对照组(P<0.05)，而用药组其mRNA表达则有下降(P<0.05)。见表1表1 第8周末动脉组织中 PDGF-B mRNA的表达注：PDGF：血小板源性生长因子。与正常组比较△P<0.05;与模型组比较▲P<0.05。

　　3 讨 论

　　本实验以兔的颈动脉为模型，兔颈动脉较粗而厚，颈总动脉管腔大小接近人的冠状动脉，损伤后能产生快速增殖反应，产生类似于临床PTCA的病理变化，且位置表浅，容易暴露，走行较直，球囊导管容易推送，容易清楚地确定损伤范围。临床上行PTCA的冠心病人几乎均同时存在高脂血症，大量研究表明，高脂血症与球囊损伤可协同刺激内膜增殖[1]。因此，本研究采用高脂喂养+球囊拉伤方法建立兔颈总动脉内皮损伤模型，更好地模仿了临床实际情况。根据研究球囊损伤后血管内膜的增殖反应在术后1～2周为高峰时间[2]，因此本试验术后继续喂养2周。

　　在RS病变中PDGF表达是诱导平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)增殖和迁移的重要因素[3]。实验研究发现损伤的内皮细胞、激活的血小板、移行于内皮下的单核细胞以及表型转化后的合成型SMC都能以自分泌或旁分泌形式释放大量的PDGF。PDGF与相应的细胞膜PDGF受体结合促进大量单核细胞粘附、增殖及向内膜下转移，促进内皮细胞、纤维母细胞、血管SMC的生长和增殖，促进SMC迁移。在已知的趋化物中，PDGF诱导增殖和迁移的作用最强。Sirois应用PDGF-A或B抗体，发现只有PDGF-B抗体可以阻止和抑制内膜下增生。提示在内膜损伤和再狭窄的形成过程中，PDGF-B可能起主要作用，而其促进血管SMC向内膜下的迁移和增殖作用，可能主要是通过与PDGF-B的结合来实现的[4]。

　　本研究显示，在模型组家兔中PDGF-B过度表达，表明PDGF-B参与了RS的形成过程。而益气活血复方组动脉壁局部表达PDGF-B明显减少，病理学观察益气活血复方组内膜增生和管腔狭窄程度较模型组亦明显减轻，提示益气活血复方可通过抑制斑块局部PDGF-B表达，阻止和抑制内膜增生，使再狭窄减轻。益气活血复方抑制PDGF-B的作用可能是其抗RS的重要机制之一。

【参考文献】  　[1]Weintraub WS，Boccuzzi SJ，KIein JL，et al.The lovastatin restenosis trial study group.Lack of effect of lovastatin on restenosis after coronary angioplasty[J].N Engl J Med，1994，331(20):1331-1337.

　　[2]Strauss BH，Chisholm RJ，Keeley FW，et al.Extracellular matrix remodeling after balloon angioplasty in a rabbit model of restenosis[J].Circ Res，1994，75(4):650-658

　　[3]Boucher P，Gotthardt M，Li WP，et al.LRP: Role in vascular wall integrity and protection from therosclerosis[J].Science，2003，300: 329-332.

　　[4]Sirois Mg.Antisenses of PDGF-B receptor inhibit intimal thickening[J].Circulation，1997，95:699.