骨髓间充质干细胞对体外损伤心肌细胞凋亡的影响

作者：郭俊芳, 张赢予， 莫亚宏， 王 好， 周艳芳， 张国辉    作者单位：江苏大学附属人民医院心内科， 江苏 镇江 212002

【摘要】  目的： 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)在体外共培养条件下对多柔比星(doxorubicin， DOX)损伤心肌细胞凋亡的影响及可能机制。方法： 贴壁法分离、培养骨髓间充质干细胞，第3代MSCs用于实验。原代培养3天的SD乳鼠心肌细胞，1.0 mg/L浓度的DOX处理4 h，建立心肌细胞损伤模型。将心肌细胞分为正常对照组、DOX损伤组、DOX损伤+MSCs共培养组。ELISA法检测细胞条件培养基内胰岛素样生长因子1(insulinlike growth factor 1，IGF1)的浓度。MTT检测MSCs条件培养基对DOX损伤心肌细胞活性的影响。并检测各组心肌细胞caspase9,caspase3活性及各组心肌细胞凋亡率。结果： 第3代MSCs及原代心肌细胞均有IGF1分泌，但MSCs条件培养基内IGF1的浓度明显高于心肌细胞。MSCs共培养组心肌细胞活性高于DOX损伤组，但低于正常对照组（P<0.05)。DOX损伤+MSCs共培养组caspase9,caspase3活性及心肌细胞凋亡率低于DOX损伤组，但高于正常对照组（P<0.05)。结论： MSCs对多柔比星诱导的心肌细胞凋亡有保护作用，这种保护作用与旁分泌机制有关。

【关键词】  骨髓间充质干细胞； 心肌细胞； 共培养； 凋亡

Antiapoptotic effects on damaged cardiomyocytes cocultured with mesenchymal stem cells in vitro

    GUO Junfang, ZHANG Yingyu, MO Yahong, WANG Hao, ZHOU Yanfang ZHANG Guohui

    (Department of Cardiology, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002, China)

    ［Abstract］  Objective:  To investigate the effects of mesenchymal stem cells(MSCs) on doxorubicin（DOX）injured cardiomyocytes apoptosis in vitro on the condition of coculture and the possible mechanism.Methods： Mesenchymal stem cells(MSCs) were isolated and purified by adherentscreening method, then expanded in vitro.The third passage was used for study.The primary cultured neonatal SD rat cardiomyocytes were exposed to 1.0 mg/L Doxorubicin for 4 h to establish experimental model of toxic cardiomyocytes after having been cultured for 3 days.The cardiomyocytes were divided into 3 groups: cultured alone(control group), DOXinjured, DOXinjured and cocultured with the MSCs.The level of insulinlike growth factor 1(IGF1) in the conditioned medium was measured with ELISA kit.The effects of MSCscondition medium on cardiomyocytes viability was determined by MTT assay.The activity of caspase9 and caspase3 were measured by caspase kits.The cardiomyocyte apoptosis was detected by Annexin VFITC. Results：  IGF1 was significantly higher in the medium from cultured MSCs than in the medium from cultured cardiomyocytes.The viable cell number was larger in MSCsconditioned medium group than that of DOXinjured group, but both decreased compared to control group(P<0.05).The activity of caspase9,caspase3 and the apoptosis rate decreased significantly in cocultured group compared with the DOXinjured group, but increased compared to control group（P<0.05). Conclusion： It  was concluded that paracrine mediators secreted by MSCs were involved in preventing DOXinduced cardiomyocytes apoptosis.

    ［Key words］  mesenchymal stem cells； cardiomyocytes； coculture； apoptosis

    近年来，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)由于具有获取方便、分化能力强、低免疫原性且无排斥反应等优点, 在修复损伤心肌、改善心功能方面有很大临床应用潜力，被国内外众多研究者所关注。传统观点认为，骨髓间充质干细胞在受损心肌微环境内能定向分化为心肌细胞［1］，改善心脏功能。但近来的一些研究对这种观点提出了质疑，认为细胞治疗促进了内生性的修复过程，而不是心肌细胞和血管内皮细胞的再生，旁分泌作用可能是其修复作用的基础［2］。本实验通过骨髓间充质干细胞与多柔比星(doxorubicin，DOX)损伤心肌细胞的体外非直接接触共培养，观察MSCs对体外损伤心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  主要材料和试剂

    1.1.1  实验动物  4周龄SD大鼠（100～120 g）5只，1～3日龄新生SD大鼠30只，雌雄不限，由江苏大学实验动物中心提供。

    1.1.2  主要试剂  新生牛血清（Hyclone公司），胎牛血清（GIBCO公司），LDMEM干粉培养基（GIBCO公司），胰蛋白酶（Sigma公司），Ⅰ型胶原酶（Sigma公司），甲基四唑蓝（MTT，Sigma公司），α横纹肌肌动蛋白抗体免疫组化试剂盒（αSA，武汉博士德生物技术有限公司），Caspase3和Caspase9检测试剂盒（南京凯基生物科技公司），Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技公司），多柔比星(DOX，浙江海正药业有限公司)。

    1.2  细胞分离和培养

    1.2.1  MSCs的分离和培养      拉颈脱臼处死4周龄SD大鼠，75%乙醇中浸泡5 min，无菌操作下取出双侧的胫骨和股骨，用装有不含血清的无菌LDMEM培养基的注射器冲洗骨髓腔和干骺端，收集冲洗获得的细胞悬液，1 500 r/min离心10 min，弃上清，用培养基反复吹打沉淀，混匀，计数，以3×108/ml的浓度种入含10%胎牛血清的完全培养基中（LDMEM培养基+10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 U/ml链霉素），并接种于50 ml的培养瓶中。在37℃,5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养48 h后首次全量换液，以后每间隔3～4 d全量换液1次，7～10 d左右长至80%融合时用0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，继续传代培养。第3代MSCs用于实验，并用流式细胞仪检测第3代MSCs表面标志CD45和CD90的表达。

    1.2.2  原代心肌细胞的分离和培养  无菌取1～3日龄乳鼠心脏，将组织块剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，加入等体积的0.08%胰蛋白酶和0.05%Ⅰ型胶原酶混合溶液，37℃恒温振荡分次消化，收集各次消化的上清液并过滤，1 000 r/min离心10 min，弃去上清后将细胞重悬于含10%新生牛血清的DMEM培养液中，然后接种于90 mm培养皿,置CO2培养箱中培养2 h，差速贴壁法去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。取心肌细胞悬液0.5 ml与等量0.3%台盼蓝液混匀，接种于细胞计数板上，于显微镜下观察，计算细胞悬液中的活细胞数，并调整细胞浓度至3×105/ml。制备心肌细胞爬片，按照αSA免疫组化试剂盒的说明进行细胞染色，进行细胞纯度鉴定。

    1.3  DOX诱导心肌细胞损伤模型及共培养体系的建立

    新分离并差速培养后的原代心肌细胞，按3×105/ml的浓度加入96孔培养板（200  μl/孔）或6孔培养板（3 ml/孔），置CO2培养箱中培养，培养72 h后用于实验。加入终浓度为1 mg/L的DOX（以含10%新生牛血清的LDMEM培养基配制）作用4 h，更换无血清培养基或含10%新生牛血清的LDMEM培养基。成功建立心肌细胞损伤模型后，在6孔培养板内置入插入式培养皿Millicell装置，Millicell装置内加入第3代MSCs悬液，心肌细胞和MSCs的比例为1∶1，建立共培养体系。

    1.4  细胞条件培养基的制备及IGF1的测定

    取传至第3代的MSCs及原代心肌细胞，分别按3×105/ml的浓度加入6孔培养板，常规培养24 h后更换为无血清培养基，继续培养48 h后吸取培养板内的培养基，2 000 r/min离心10 min，留取上清液作为条件培养基，20℃保存。ELISA试剂盒检测条件培养基内胰岛素样生长因子1（IGF1）的浓度。

    1.5  实验分组

    按照实验要求分为正常心肌细胞对照组，DOX损伤组，DOX损伤+MSCs共培养组或DOX损伤+MSCs条件培养基组。

    1.6  检测指标及方法

    1.6.1  MTT法检测心肌细胞存活力  96孔培养板内培养72 h后的心肌细胞，分为正常心肌细胞对照组15孔：4 h后更换为无血清培养基；DOX损伤组15孔：1 mg/L浓度的DOX作用4 h后更换为无血清培养基；DOX损伤+MSCs共培养组15孔，1 mg/L浓度的DOX作用4 h后更换为MSCs条件培养基。继续培养48 h，每孔依次加入MTT及二甲基亚砜，酶标仪检测各孔光密度D值（490 nm）。

    1.6.2  心肌细胞caspase9,caspase3活性的测定  6孔培养板内培养72 h后的心肌细胞，分为正常心肌细胞培养组、DOX损伤组、DOX损伤+MSCs共培养组。每组均为6孔。继续培养48 h后按照试剂盒的说明测定各组心肌细胞caspase9和caspase3的活性。

    1.6.3  Annexin VFITC流式细胞仪检测心肌细胞凋亡  6孔板内原代培养72 h后的心肌细胞，按照上述方法分为正常对照组、DOX损伤组、DOX损伤+MSCs共培养组，每组均为6孔，48 h后按照Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒的说明检测各组心肌细胞凋亡情况。

    1.7  统计学处理

    实验数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS11.5统计软件进行处理，多组均数间比较采用方差分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  MSCs培养、扩增和鉴定

    原代MSCs培养24 h后即有少量细胞贴壁，细胞形态呈多边形或梭形，随着时间的推移，贴壁细胞增多，并可见细胞克隆形成，第7～10天左右细胞可达80%～90%融合。传代的细胞生长比原代要快，12 h后几乎全部贴壁并迅速分裂增殖，形态更均匀，为成纤维样，排列呈螺旋状或漩涡状。流式细胞仪检测第3代MSCs CD90(动物干细胞表面标志)表达阳性，阳性率达94.2%，而CD45(造血细胞表面标志)阴性。

    2.2  心肌细胞培养和鉴定

    差速培养后的心肌细胞呈圆形，0.3%台盼蓝染色显示心肌细胞存活率在90%以上。培养12 h后细胞基本贴壁，逐渐变为梭形、三角形、多边形等形态，并出现自发性搏动，第3天细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇，搏动呈同步性，频率为80～150次/min。αSA免疫组化染色显示胞质肌动蛋白染色阳性细胞在95%以上。

    2.3  条件培养基内IGF1测定结果

    结果显示体外培养的MSCs及心肌细胞均有IGF1的分泌，但MSCs条件培养基内IGF1的浓度明显高于心肌细胞条件培养基（图1），差异有统计学意义（P<0.05)。

    2.4  MSCs条件培养基对DOX损伤心肌细胞活性的影响

    实验结果表明，DOX损伤组心肌细胞活性明显下降，DOX损伤+MSCs共培养组心肌细胞活性增加，但仍低于正常心肌细胞对照组，差异有统计学意义（图2）。

    2.5  各组心肌细胞caspase9和caspase3活性的变化

    检测结果如表1所示，DOX损伤组及MSCs共培养组心肌细胞caspase3,caspase9 活性均明显高于正常对照组，而MSCs共培养组caspase3,caspase9 活性低于DOX损伤组，差异具有统计学意义(P<0.05)。表1  MSCs对DOX损伤心肌细胞caspase9和caspase3活性的影响

    2.6  共培养条件下MSCs对DOX诱导损伤心肌细胞凋亡的影响

    1 mg/L DOX作用4 h后，心肌细胞早期凋亡率及总凋亡率均增加，和MSCs共培养48 h后，凋亡率下降，但与正常心肌细胞对照组相比，凋亡率仍有增加，差异有统计学意义（图3和表2)。表2  MSCs对DOX诱导损伤心肌细胞凋亡的影响

    3  讨  论

    病理性细胞凋亡是心肌细胞丧失的形式之一，是心血管疾病发生和发展的基础［3］。虽然最近的研究显示心脏内存在干细胞，心肌坏死后有少量心肌干细胞发生分裂增生［4］，但发生分裂增生的心肌干细胞数量极少，主要靠形成瘢痕组织进行修复，最终发展成慢性心力衰竭。因MSCs具有自我复制能力、多向分化潜能及低免疫原性，国内外很多学者致力于MSCs在心血管疾病治疗方面的研究,从基础实验到临床前期研究，一些客观检查指标表明疗效显著，对改善病情和预后起到了积极的作用。

    MSCs移植改善受损心脏功能的机制目前存在很大的争议。Stamm等［5］研究认为MSCs移植到受损的心脏组织内以后，能定向分化为心肌细胞和血管内皮细胞，从而替代了受损的心肌细胞，改善心脏功能。但Shake等［6］研究发现，在心肌细胞移植后，虽然可以在心肌和血管内皮细胞中观察到荧光标记的细胞存在，但数量非常有限，90%左右的移植细胞在移植后24 h内死亡，而细胞移植72 h后心脏的功能就有了明显的提高，心肌细胞定向分化难以解释心脏功能改善的结果，认为这可能与移植细胞分泌内源性血管活性物质有关，并非移植细胞分化为心肌细胞再生心肌的效应。

    新近有实验表明，在心肌梗死的动物模型中，不仅表现为细胞移植后心功能的改善，将转染AKT基因的MSCs培养后的上清液（无细胞）注入体内，心脏功能也有明显的改善［7］。这些均对以往认为MSCs是通过分化为心肌细胞而起作用的观念提出了质疑，认为MSCs对心脏的修复功能包括了旁分泌因子的作用，这些旁分泌因子有助于抑制心肌细胞的凋亡、促进微血管和毛细血管的生成、抑制胶原纤维的合成和心肌的重构。

    多柔比星（DOX）是临床常用的化疗药物，与心肌细胞有特殊的亲和力，容易在心脏内特异性蓄积并产生心脏毒性，长期用药可引起剂量依赖性的充血性心力衰竭，常用来制造心衰动物模型。DOX的心脏毒性主要与其产生活性氧自由基（ROS）引起脂质过氧化及促进心肌细胞凋亡有关。半胱天冬蛋白酶（caspase）是参与细胞凋亡机制的主要成分，当心肌细胞在DOX作用下，细胞色素C释放，激活caspase9，后者再激活其下游的caspase3，诱导心肌细胞凋亡［8］。

    本实验结果显示体外培养MSCs及心肌细胞均有自分泌能力，能分泌胰岛素样生长因子（IGF1），前者分泌IGF1的能力超过后者，而IGF1在体内外能促进多种细胞的增殖、分化，同时能抑制细胞的凋亡和坏死，对心脏的发育、心肌细胞肥大、再生及抑制心肌细胞凋亡有重要作用，是一种重要的调节因子［9］。MTT法检测心肌细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性，能间接反映心肌细胞的生长情况，本组结果提示MSCs条件培养基可促进受损心肌细胞的生长，与MSCs分泌的促生长因子有关。

    Millicell插入式培养皿是一种特殊的细胞培养装置，其半透膜的孔径为0.4 μm，能允许细胞因子通过，而细胞不能通过。MSCs和DOX损伤心肌细胞通过Millicell装置共培养，在模拟心肌微环境但非细胞直接接触的条件下，MSCs对DOX诱导的caspase9及caspase3激活有抑制作用，同时抑制了DOX诱导的心肌细胞凋亡。结合细胞条件培养基内细胞因子检测结果，提示MSCs能分泌促生长因子和抗凋亡因子，并通过旁分泌途径对心肌细胞产生了保护作用。

    总的来说，MSCs作为成体干细胞，在治疗心血管疾病的领域具有强大的吸引力，但在临床实践中MSCs要达到所期望的效果还有许多困难要克服，还面临许多挑战，仍然需要更多的基础和临床试验来明确细胞的生物学特性及作用机制，以进一步优化MSCs的治疗。

【参考文献】［1］ Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart［J］.Circulation,2002,105(1):93-98.

［2］ Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, et al.Marrowderived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms［J］.Circ Res,2004,94(5):678-685.

［3］ Lockshin RA.Programmed cell death: history and future of a concept［J］.Soc Biol, 2005, 199(3): 169-173.

［4］ Beltrami AP， Urbanek K, Kajstura J，et al.Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction［J］.New Engl J Med,2001,344(23):1750-1757.

［5］ Stamm C, Westphal B, Kleine HD, et al.Autologous bonemarrow stemcell transplantation for myocardial regeneration［J］.Lancet,2003,361(9351):45-46.

［6］ Shake JG, Gruber PJ, Baumqartner WA, et al.Mesenchymal stem cell implantation in a swin myocardial infarct model: engraftment and functional effects［J］.Ann Thorac Surg, 2002,73(6): 1919-1925.

［7］ Gnecchi M, He H, Liang OD, et al.Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Aktmodifie mesenchymal stem cells［J］.Nat Med,2005,11(4):367-368.

［8］ Wu S, Ko YS, Teng MS, et al.Adriamycininduced cardiomyocyte and endothelial cell apoptosis in vitro and in vivo studies［J］.J Mol Cell Cardiol,2002,34(12):1595-1607.

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