恒磁场对人脐动脉血管平滑肌细胞胞浆游离钙离子浓度的影响

作者:冯旭阳,徐瑞芬,宋博,王海

作者单位：第四军医大学：西京医院心脏内科；口腔医院麻醉科，陕西西安 710032

     【摘要】  目的 研究恒磁场对培养的人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMC)胞浆内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响，探讨恒磁场抑制VSMC增殖的作用机制。方法 离体培养人脐动脉VSMC，不同强度的恒磁场垂直作用于VSMC，应用激光共聚焦显微镜观察恒磁场对VSMC胞浆[Ca2+]i的影响。结果 5mT的恒磁场作用于VSMC后10-50min[Ca2+]i较对照组明显下降，20min下降最明显；其平滑肌细胞的Ca2+荧光强度明显弱于对照组，至60min接近对照组。结论 恒磁场对VSMC胞浆[Ca2+]i有明显降低作用，可能是抑制VSMC细胞增殖的机制。为经皮冠状动脉成型术(PTCA)术后再狭窄的治疗提供了新的理论基础。

【关键词】  电生理学；游离钙；恒磁场；血管平滑肌细胞(VSMC)

　　Effect of constant magnetic fields on intracellular free calcium of　human umbilical arterial vascular smooth muscle cells

　　Feng Xuyang, Xu Ruifen, Song Bo, Wang Haichang

　　(Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fouth Military Medical University; Department of anesthesiology, Stomatology Hospital,Fouth Military Medical University, Xian 710032, China)

　　ABSTRACT: Objective  To study effects of constant magnetic fields (CMF) on the intracellular free calcium of human umbilical arterial vascular smooth muscle cells to discuss the mechanism of CMF affecting the proliferation of VSMC. Methods  The intracellular free calcium concentration of human umbilical arterial vascular smooth muscle cells was detected by laser scanning confocal microsopy. Results  The CMF affected the intracellular free calcium concentration of human umbilical arterial vascular smooth muscle cells. The CMF (5mT) caused a persistent decrease of intracellular free calcium concentration of VSMC from 10min to 50min. Conclusion  The CMF could inhibit proliferation of VSMC by decreasing the intracellular free calcium constant magnetic field concentration of VSMC. The CMF could markedly inhibit proliferation of VSMC, which might be useful in treatment of RS after PTCA.

　　KEY WORDS: electrophysiology; intracellular free calcium; constant magnetic fields; vascular smooth muscle cells

　　动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖是经皮冠状动脉成型术(PTCA)后再狭窄的主要病理特征，抑制其增殖是防治PTCA术后再狭窄的重要环节。研究表明适宜强度的恒磁场(constant magnetic field, CMF)对VSMC的增殖有抑制作用[1]，其机理尚不明确。已有报道细胞中的带电离子如钾、钠、氯、钙、镁、磷等，在磁场的作用下，其荷电能力改变,影响离子的移动速度和排列形式,使细胞代谢所需酶的活性或功能受到干扰,影响细胞的增殖能力[2]。本实验采用激光共聚焦显微镜，研究CMF对培养的人脐VSMC内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响，探讨CMF影响VSMC增殖的作用机理。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  恒磁场购自西北工业大学稀土永磁研究所，平均磁感应强度为5mT，长132mm，宽92mm，厚3-6mm，N极与S极对置，培养板置于两极中间。激光共聚焦显微镜(MRC1024)由美国BIORAD公司生产。Fluo3/Am购自美国BIORAD公司。

　　1.2  人脐动脉VSMC的培养  无菌条件下取胎儿脐带，分离出脐动脉，用镊子剥去动脉外膜，剪成约1mm的小环，种植于培养瓶壁，置于37℃、50mL/L CO2孵箱内2h，待组织块能牢固贴于瓶壁时(约1.5-2h)，加入3mL含有100mL/L新生牛血清、成纤维生长因子(bFGF，5μg/L)和表皮生长因子(EGF 10μg/L)的DMEM培养液中，放入CO2孵箱内静置培养。待VSMC生长到一定密度后，用1.25g/L(0.125%)胰蛋白酶消化，机械分散成细胞悬液，传代培养，取其中3-10代作为实验用细胞。

1.3  实验分组  对照组：将含100mL/L新生牛血清、bFGF(5μg/L)和EGF(10μg/L)的DMEM的培养液与VSMC的混悬液(细胞浓度为1×105/mL)10μL加入特殊培养皿，设8个复孔。在无磁场作用的状态下在CO2孵箱内静置培养24h。恒磁场组：共分6组，每组设8个复孔。细胞浓度及培养液同对照组，静止培养24h后置于CMF两极之间的培养板分别培养10、20、30、40、50、60min。

　　1.4  人脐动脉VSMC[Ca2+]i的测定[34]

　　1.4.1  测定原理  Fluo3是一敏感性钙指示剂，能特异性与Ca2+结合，并在一定波长(488nm)激光激发下产生荧光，其荧光强度与Ca2+浓度成正比，因而可用于Ca2+浓度的定量观察。但Fluo3为极性大的酸性化合物，难以通过细胞膜，而当其结合上亲脂的2酰羟甲基酯成为脂溶性的Fluo3/AM，在与细胞温育时，很容易透过细胞膜，胞浆内的非特异性酯酶将其酯基脱去生成游离的Fluo3而与细胞内Ca2+结合[34]。Ca2+图像经过光电倍增管和数字传入式摄像机，输入高速度计算机系统，经过处理得到清晰的细胞内分布图像，利用其图像量化、分析系统进行图像分析，可换算出某一特定区域内荧光强度随时间变化的曲线。

　　1.4.2  Fluo3/AM的荷载  采用酶解法分离出单个平滑肌细胞，种植于特殊的培养皿中，使其贴壁，于37℃避光条件下用Fluo3/AM(5.0μmol/L)荷载。60-90min后用Tyrode液洗涤细胞3次，洗去细胞外液残余染料，最后保留少许细胞外Tyrode液。

　　1.4.3  VSMC [Ca2+]i的测定  Fluo3/AM荷载的人脐动脉VSMC在共聚焦显微镜下扫描细胞内荧光强度，激发波长488nm，放射波长526nm。通过荧光定量分析得到[Ca2+]i。每孔测定8个VSMC，取其平均值作为该组VSMC内游离Ca2+浓度。

　　1.5  统计学分析  实验重复8次，所有数据均用(±s)表示，资料分析采用SPSS10.0统计软件，组间比较采用方差分析和Dunnettt检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  VSMC的鉴定  相差显微镜下VSMC 呈梭形或长梭形，可重叠生长达多层，高低起伏，呈典型的“谷与峰”样生长。α肌动蛋白免疫组织化学染色后可见细胞浆中大量平行条状棕黄染色，所有细胞均呈阳性染色。

　　2.2  培养VSMC的[Ca2+]i变化  CMF对人脐VSMC未作用时(对照组)，细胞内荧光强度较高，作用后10min，荧光强度即开始下降，20min下降最明显(P<0.05)，30-50min荧光强度逐渐升高，但仍低于对照组(P<0.05)；60min荧光强度接近对照组。说明CMF作用于VSMC后10-50min能抑制胞浆游离钙浓度(图1、表1)。

　　表1  恒磁场对人脐动脉血管平滑肌细胞内钙离子浓度的影响（略）

　　Table 1  Effect of constant magnetic fields on intracellular free calcium of human umbilical arterial vascular smooth muscle cells

　　*P<0.05 vs. control group

　　3  讨论    　　我们前期研究结果表明，平均磁感应强度为 5mT的CMF作用于人脐VSMC后MTT值和3HTdR掺入量明显低于对照组，VSMC进入DNA合成期(S期)和有丝分裂期(G2/M期)期比对照组明显减少，说明平均磁感应强度为5mT的CMF有抑制VSMC DNA合成作用，对VSMC增殖确实有明显的抑制作用[1]。目前其机理尚在探讨之中。    　　Ca2+作为细胞生命活动中信息传递的第二信使,是实现心肌细胞功能的基础因素，其不仅参与细胞多种生理功能的调节，同时在血管损伤、VSMC迁移和增殖的调节中也起着重要作用。目前对于平滑肌(SMC)增殖的研究表明，许多生长因子、调节肽、活性物质和离子(如Ca2+)都能影响VSMC的増生。另有学者认为甘油二脂蛋白激酶C和三磷酸肌醇(IP3)Ca2+是VSMC增殖信号传递的两条重要通路[5]。

　图1  VSMC各组荧光密度图（略）

　　Fig.1 VSMC fluorescence photodensity figure of groups

　　A: control; B: in CMF 10min; C: 20min; D: 30min; E: 40min; F: 50min; G: 60min  

　　研究显示，培养的VSMC培养液的Ca2+浓度必须大于100μmol/L，促有丝分裂因素才能使细胞由静息状态(G0)进入S期，合成DNA[6]，可见Ca2+是VSMC增殖的关键因素之一。各种生长因子如血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管紧张素、内皮素等都可以促进肌浆网Ca2+ATPase表达及储存钙释放，增加细胞内游离Ca2+浓度，引起fos或egr1基因的表达，从而促进VSMC增殖。此外，有学者应用12羟花生四烯酸(12HETE)可以诱导VSMC向内膜下迁移，应用Ca2+载体A23187可以促进VSMC迁移；相反应用Ca2+通道的阻断剂可以抑制VSMC迁移[7]。因此，VSMC内膜下迁移亦是Ca2+依赖性的。    　　Ca2+信使在VSMC的功能调节中起非常重要的作用。在以膜肌醇磷脂代谢为基础的双信使系统中，其中IP3/Ca2+信号转导分支，就是通过胞内Ca2+动员进一步启动Ca2+信号系统而参与广泛的生理过程。胞浆内[Ca2+]i适当增高，可促进细胞的增殖，相反，抑制胞浆内[Ca2+]i增高，则可以抑制细胞的增殖[810]。    　　我们的研究表明，恒磁场对人脐动脉VSMC胞浆内的Ca2+有影响。5mT的CMF用于VSMC后10-50min，[Ca2+]i较对照组明显下降，20min下降最明显；其平滑肌细胞的Ca2+荧光强度明显弱于对照组，至60min接近对照组。说明恒磁场对VSMC胞浆内的Ca2+有降低作用。Galvanovskis等[11]发现，50Hz的交变磁场降低人白血病T细胞胞浆内钙震荡。Pacini等[12]发现，0.2T恒磁场对神经元细胞有重塑作用，作用于FNCB4细胞15min后细胞胸腺嘧啶掺入和肌醇类酯的信号转导受到抑制。这些与我们的实验结果类似。    　　恒磁场对VSMC胞浆内的Ca2+浓度有明显降低作用，在抑制VSMC增殖中可能发挥重要作用，有望成为治疗PTCA术后再狭窄的有效方法。该方面进一步的深入研究尚待进行。

【参考文献】  　　[1]冯旭阳，贾国良，张荣庆，等. 恒磁场对人脐动脉平滑肌细胞增殖的抑制效应 [J]. 第四军医大学学报, 2001, 22(21):19891991.

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　　[10]陈丁丁. 一类新的第二信使—花生四烯酸脂氧合酶代谢物 [J]. 生物化学与生物物理进展, 1989, 16(5):119124.

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